一种基于吲哚-氧二唑结构的荧光探针，用于检测胸外科手术中人体血清白蛋白的水平

《Analytical Biochemistry》：An indole-oxadiazole-derived fluorescent probe for the detection of the human serum albumin level in thoracic surgery

血清白蛋白荧光探针开发及其在胸外科手术中的应用。该探针基于吲哚-恶二唑结构，通过FRET和TICT机制实现HSA特异性检测，检测限0.0002 mg/mL，兼具高特异性和低细胞毒性，并成功应用于活细胞成像。

　　

孙汉章|左光磊|吴月明|楼阳勇|冯江|郑玉龙

中国浙江省东阳市东阳人民医院胸外科，邮编322100

摘要

在本研究中，我们开发了一种基于吲哚-噁二唑衍生物的荧光探针InOx-HSA，用于检测胸外科手术中的HSA（人血清白蛋白）水平。该探针在310 nm的激发光下，405 nm至505 nm范围内表现出比率荧光响应。InOx-HSA能够结合HSA中的苯丁唑酮位点，并通过F?rster共振能量转移（FRET）和分子内电荷转移（TICT）机制产生荧光增强效应。探针与HSA之间的结合反应在30分钟内完成，其稳定性范围为7.0-9.0。该探针的荧光响应具有剂量依赖性，检测限为0.0002 mg/mL。InOx-HSA具有高特异性和低细胞毒性。通过药物竞争实验、胰蛋白酶消化以及高温蛋白变性实验验证了其结合位点。该探针能够在活体肺细胞中可视化HSA，并揭示胸外科手术过程中HSA的消耗情况。

引言

胸外科是一门专门研究胸腔器官（主要包括食管、肺和纵隔）诊断与治疗的医学学科[1]、[2]。胸外科相关疾病常发生在心脏和肺等关键器官上，这些疾病会严重影响患者的生存功能，从而对生命构成严重威胁[3]、[4]。因此，胸外科医生必须充分认识潜在风险，了解器官与疾病之间的相互作用，以保护病变器官的正常功能[5]、[6]。由于胸外科手术的高风险性，尤其是血压骤降和氧气供应不足等问题[7]、[8]，需要特别精确的操作。除了手术中的严重并发症外，这些情况还可能导致意识改变、认知功能障碍、注意力不集中、定向障碍、记忆力减退、睡眠-觉醒周期紊乱以及肺部炎症[9]、[10]。血压骤降（通常由出血引起）必须尽快得到处理。与输血相比，补充人血清白蛋白（HSA）是短期内维持血压的重要方法[11]。HSA在循环系统中起着至关重要的作用[12]，它是运输营养物质、代谢物和药物的主要蛋白质[13]，同时对调节胶体渗透压也至关重要[14]。先前的研究表明，HSA水平异常与冠心病、多发性骨髓瘤、糖尿病、神经代谢紊乱和肝硬化等疾病有关[15]、[16]，其中最值得关注的问题是血压异常[17]。正常情况下，血浆中的HSA水平为35至50 mg/mL。HSA水平是临床前诊断和治疗的重要指标[18]。传统的物理方法（如血压测量）存在较大波动，而包括HSA在内的分子指标（如γ-球蛋白和葡萄糖）结合荧光标记或荧光探针能实现更准确的检测[19]。目前用于检测HSA的方法包括电化学、蛋白质组学技术和放射免疫测定[19]。近年来，由于荧光方法的便利性和生物相容性，这类方法得到了广泛应用[20]。研究人员开发了多种策略，如模拟绿色荧光蛋白、利用纳米粒子增强信号强度、添加荧光标记等[21]、[22]、[23]。特别是小分子荧光探针的结合位点策略，能够有效区分HSA与其类似物牛血清白蛋白（BSA）[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。这种高特异性对于生物产品质量控制和胸外科临床操作都具有重要意义。为提高检测性能，新型荧光探针的研发仍是医学和化学生物学领域的重要课题[33]。在本研究中，我们设计、合成并测试了一种用于胸外科手术中HSA检测的荧光探针（图1）。根据化学生物学惯例，该探针以结构特征“吲哚-噁二唑”和检测对象“HSA”命名。吲哚和噁二唑结构单元的选取基于它们与HSA的相互作用，这种相互作用显示出潜在的光学活性[33]、[34]、[35]。这两种结构特征决定了其对HSA的特异性，同时也构成了荧光探针的结合基础，因此命名为InOx-HSA。与HSA孵育后，InOx-HSA能够结合苯丁唑酮位点并固定其构象。在310 nm激发光下，通过FRET和TICT机制在505 nm处观察到显著的荧光信号。在游离状态下，分子间距离较远导致FRET效应关闭；而当构象受到HSA限制时，分子旋转受限，从而激活TICT效应，缩短的分子间距离促进了FRET效应。这两种机制的结合产生了荧光响应。随后对探针的检测能力进行了系列测试，并对酶指标的稳定性进行了测量。共聚焦成像技术用于观察活体A549细胞中的HSA水平，同时研究了缺氧对检测结果的影响。InOx-HSA有望满足胸外科手术的实际需求。

材料与方法

本研究使用的化学品和酶均购自上海麦克林生化科技有限公司（中国）。细胞系来自美国典型培养物收藏中心（ATCC），并保存在浙江大学金华研究院的中心实验室。

InOx-HSA的化学合成

InOx-HSA探针的合成分为三个主要步骤（图2）：首先，N-乙基-吲哚-3-羧酸与肼水合物反应生成N-乙基-吲哚-3-碳酰肼中间体；随后，通过氢氧化钾和二硫化碳进行环化反应，形成含有吲哚结构的1,3,4-噁二唑-2-硫醇杂环；最后，硫醇基团与3,4,5-三甲基氧基苄溴在苄位发生反应，得到最终的探针。

结论

本研究开发了一种基于吲哚-噁二唑衍生物的荧光探针，用于胸外科手术中HSA的检测。所制备的InOx-HSA探针能够结合HSA中的苯丁唑酮位点，在310 nm激发光下405 nm至505 nm范围内产生比率荧光信号，且荧光增强明显。这种荧光响应基于FRET和TICT机制。InOx-HSA与HSA孵育前后的FQY值分别为0.09。

作者贡献声明

孙汉章：撰写初稿、数据验证、方法设计、数据分析、概念构思。左光磊：撰写初稿、数据验证、方法设计、资金争取、数据分析、概念构思。冯江：撰写与编辑、数据验证、方法设计。郑玉龙：撰写与编辑、数据验证、项目监督、资金争取、概念构思。吴月明：撰写与编辑、方法设计、数据分析。

利益冲突声明

本研究不存在利益冲突。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学基金（LQ24H070005）、金华市科技创新计划项目（2023-4-032）和浙江省新型生产力研究中心项目（202502）的支持。