《Bioresource Technology》：Production of pure all-trans retinal from agricultural byproducts by metabolically engineered
Corynebacterium glutamicum using two-phase cultivation
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纯视黄醇生物合成新策略：代谢工程改造枯草芽孢杆菌耦合两相培养系统，利用糖蜜为原料实现高效生产（104.9 mg/L）且无其他视黄类物质污染，突破化学合成局限推动绿色制造。
郝文辉|山田俊吾|平野洋子-原|原清隆|辻阳太
金泽大学前沿科学研究所，金泽市角马町，石川县920-1192，日本
摘要
视黄醇类化合物包括视黄醛、视黄醇（维生素A）和视黄酸，属于维生素A及其生物活性代谢物，广泛应用于制药、医疗和化妆品领域。其中，视黄醛因具有高生物效价和低皮肤刺激性的良好组合，以及强大的抗菌活性，在护肤应用中受到越来越多的关注。然而，微生物生产视黄醛通常会产生与其他视黄醇类化合物的混合物，并且需要昂贵的培养基。本文报道了利用经过代谢工程改造的Corynebacterium glutamicum从农业副产品中纯化视黄醛的方法。通过阻断下游代谢途径并增强类胡萝卜素生物合成，构建了一种能够生产视黄醛的菌株。为了将番茄红素转化为视黄醛，引入了两个相关基因。由于视黄醛具有脂溶性且易氧化的特性，本研究采用了使用和丁基羟基甲苯的两相培养系统进行原位提取和稳定处理。实验确定视黄醛生产的最佳温度为21°C，其产量是最佳生长温度30°C时的2.6倍。以糖蜜作为碳源和维生素来源，摇瓶培养可产出生物量浓度为30.7 mg/L的视黄醛（基于水相体积计算），且未产生其他视黄醇类化合物。在2.5升罐式发酵器中进行的大规模培养中，同样仅从糖蜜中获得了104.9 mg/L的视黄醛（在相中的浓度为2,099 mg/L），且未生成其他视黄醇类化合物。本研究展示了一种利用可再生资源生产纯视黄醛的经济高效且可持续的生物方法，为工业化生产奠定了基础。
引言
视黄醇类化合物（包括全反式视黄醛、全反式视黄醇和全反式视黄酸）在多种生理过程中发挥着关键作用，如保护视力、调节细胞增殖和更新以及维持大脑功能（Clagett-Dame和Knutson，2011；álvarez等人，2014）。这些特性使得它们被广泛用于护肤品、医疗产品和药品中，预计其复合年增长率将达到6.5%，到2033年市场规模将增长至30.5亿美元（Louren?o等人，2024）。
在护肤应用中，视黄酸表现出强大的生物活性，例如促进细胞更新和迁移，以及刺激胶原蛋白和糖胺聚糖的合成，从而具有显著的抗衰老效果（Konisky等人，2024）。然而，由于其强烈的皮肤刺激性，视黄酸仅限处方使用。因此，需要经过两次酶促转化（先转化为视黄醛再转化为视黄酸）的视黄醇被广泛用于非处方护肤品中。从2025年起，欧盟规定身体乳液中视黄醇的最大允许浓度为0.05%，而在所有其他涂抹型和冲洗型化妆品中则为0.3%（EU 2024/996）。这一监管变化使得视黄醛成为一种有前景的替代品，因为其生物利用度大约是视黄醇的十倍，且皮肤刺激性相对较低（Konisky等人，2024）。此外，视黄醛对引起痤疮的丙酸杆菌具有最强的抗菌活性（Pechère等人，1999），这一特性预计将进一步增加其在护肤行业的吸引力。
目前，商业上的视黄醛主要通过化学合成石油衍生原料来生产（Parker等人，2016）。鉴于建立碳中和社会的需求日益增加，使用可再生生物质通过微生物发酵进行生物合成变得至关重要。已有研究利用大肠杆菌、酿酒酵母和Yarrowia lipolytica实现了视黄醛的微生物生产（Jang等人，2011；Jang等人，2015；Park等人，2022；Sun等人，2019；Hu等人，2022）。特别是在酿酒酵母中，通过整合β-胡萝卜素途径和编码β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶（BCMO）的基因，并采用进行两相培养，成功实现了每升2,094 mg的视黄醛产量和1,256 mg的视黄醇产量（Sun等人，2019）。然而，大多数研究报道的产物都是视黄醛与其他视黄醇类的混合物，这可能是由于宿主微生物中存在内源性脱氢酶。在实际应用中，需要纯视黄醛而不含其他视黄醇类化合物（Hu等人，2022）。为此，通过删除四个醇脱氢酶基因和一个醛脱氢酶基因对酿酒酵母进行了代谢工程改造，从而防止视黄醛转化为视黄醇和视黄酸，实现了69.13 mg/L的纯视黄醛积累（Mo等人，2022）。此外，在大肠杆菌中敲除编码醛还原酶的ybbO基因后，减少了视黄醇的生成并提高了视黄醛的产量。通过对甲瓦酮途径进行系统代谢工程改造，并通过敲除七个关键代谢基因将碳流重新导向乙酰辅酶A，视黄醛的产量提升至245.73 mg/L（Liu等人，2025）。然而，大多数关于微生物视黄醛生产的研究依赖于昂贵的培养基、维生素和精制糖，这些因素限制了其工业化进程。
Corynebacterium glutamicum是一种革兰氏阳性、兼性厌氧细菌，广泛用于生产多种有用的化学物质，如氨基酸、二胺、有机酸和醇类（Becker等人，2018；Tsuge和Matsuzawa，2021）。C. glutamicum还能自然产生C50类胡萝卜素脱普伦诺黄质，该化合物通过非甲瓦酮途径和类胡萝卜素途径合成（Heider等人，2012；Henke等人，2017）。利用这一特性，C. glutamicum已被用于生产番茄红素、β-胡萝卜素、α-胡萝卜素和虾青素等类胡萝卜素，显示出作为类胡萝卜素生产微生物平台的潜力（Heider等人，2014；Li等人，2021）。然而，C. glutamicum》尚未被用于生产视黄醇类化合物。
糖蜜是糖工业的副产品，其营养成分复杂（Zhang等人，2021）。它含有丰富的碳水化合物，其中蔗糖为主要成分（Khatun等人，2021），同时还含有氨基酸、维生素、无机盐和微量元素（El Asri和Farag，2023）。重要的是，糖蜜的成本仅约为精制葡萄糖的40%（Ma等人，2023），使其成为包括C. glutamicum在内的微生物生长的廉价且有效的碳源，因此在利用C. glutamicum进行氨基酸工业生产中得到广泛应用（Jamir等人，2021；Zheng等人，2021）。
在本研究中，我们探讨了利用C. glutamicum作为宿主，以糖蜜为碳源和维生素来源，经济高效地生产纯视黄醛的潜力。通过将两个异源基因引入经过广泛改造的番茄红素生产菌株中，构建了能够生产视黄醛的菌株，并优化了培养条件以实现高效生产。最后，在2.5升生物反应器中进行了大规模生产。据我们所知，这是首次利用C. glutamicum以及廉价合成培养基生产纯视黄醛的报道。
菌株与培养
本研究使用的所有细菌菌株和质粒列于表S1中。大肠杆菌菌株在37°C下于Luria–Bertani培养基中培养。除非另有说明，C. glutamicum ATCC 13032及其衍生菌株在30°C下于添加了2%（w/v）葡萄糖或蔗糖的brain–heart infusion（BHI）培养基中培养。必要时，会在培养基中添加卡那霉素（大肠杆菌 50 μg/mL，C. glutamicum 25 μg/mL）。微孔板上的细胞生长情况如下
优化代谢途径以构建高产番茄红素的菌株
C. glutamicum能够合成类胡萝卜素脱普伦诺黄质，该化合物会导致细胞呈现黄色（Heider等人，2012）。该化合物的合成始于1-脱氧-x-木酮糖-5-磷酸，而1-脱氧-x-木酮糖-5-磷酸是由甘油醛-3-磷酸（G3P）和丙酮酸作为前体合成的（图1）。通过由八步酶促反应组成的非甲瓦酮途径，脱普伦诺黄质进一步通过类胡萝卜素生物合成途径中的五个反应生成
结论
本研究通过增强前体供应、采用两相培养系统以及优化培养条件，实现了利用可再生生物质经济高效地生产纯视黄醛的目标。经过改造的菌株在以糖蜜为碳源的廉价合成培养基中进行批式发酵，产出了每升104.9 mg的纯视黄醛（在相中的浓度为2,099 mg）。这些发现表明
作者贡献：CRediT
WH负责研究、验证和初稿撰写；SY负责验证；YHH负责监督和资源提供；KYH负责监督和资源提供；YT负责概念设计、研究、资金获取、项目管理和撰写及审稿编辑。
CRediT作者贡献声明
郝文辉：初稿撰写、验证和研究。山田俊吾：验证。平野洋子-原：监督和资源提供。原清隆：监督、资源提供和概念设计。辻阳太：撰写和审稿编辑、项目管理和资金获取、概念设计。
利益冲突声明
作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务利益和个人关系：辻阳太持有金泽大学的专利申请；郝文辉持有金泽大学的专利申请；原清隆持有静冈大学的专利申请。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到了GteX Program Japan（项目编号JPMJGX23B4）的支持。此外，还得到了JST SPRING（项目编号JPMJSP2135）对WH的支持。
