《Bioresource Technology》：Sustainable production of β-caryophyllene from fructose and carbon dioxide in Cupriavidus necator H16 through pathway enhancement and global regulatory optimization
编辑推荐：
高效二氧化碳固定生产香叶烯的铜绿假单胞菌H16代谢工程策略研究。通过引入香叶烯合酶基因并阻断PHB合成途径，结合增强MEP途径流量、改善辅因子供应和优化全局调控（特别是fnr基因过表达），使香叶烯产量提升42.3倍至48.67 mg/L，创下单碳微生物香叶烯生产最高记录。
唐若浩|高旭敏|戴存熙|范亚茹|马光泽|王倩|秦晓春|杨建明
中国山东省济南市济南大学生物科学与技术学院，邮编250024
摘要
Cupriavidus necator H16是一种能够氧化氢的细菌，具有化学自养生长能力，并能以二氧化碳（CO2）为唯一碳源进行生物合成。这种微生物已被改造为能够将CO2转化为多种高价值化合物；然而，由于代谢效率低下且调控机制尚不明确，其在萜类化合物自养生物合成中的应用仍然有限。在这项研究中，我们开发了一种高效的C. necator H16细胞工厂，用于自养生产β-石竹烯——一种在食品、化妆品和生物燃料领域具有巨大潜力的倍半萜类化合物。首先，通过引入β-石竹烯合成酶基因并破坏聚羟基丁酸（PHB）的生物合成途径，构建了能够生产β-石竹烯的菌株。随后，通过三个工程模块进一步提高了产量：增强MEP途径的流量、改善辅因子的可用性以及优化整体调控机制。值得注意的是，全局转录调节因子fnr被确定为提高C. necator H16产量的关键因素。转录组分析表明，fnr的过表达促进了酶的成熟并提高了生物合成途径中的电子传递效率。最终，通过综合代谢工程策略，从CO2中生产的β-石竹烯产量提高了42.3倍，达到了48.67?mg/L的最终浓度。这代表了迄今为止报道的最高产量。这些结果突显了非光合微生物平台在从CO2生产β-石竹烯方面的工业潜力。
引言
过量的二氧化碳（CO2）排放因其严重的环境影响而引发了全球性的关注（Lee等人，2025年）。因此，利用CO2已成为一个战略目标，重点是通过碳负方法实现“碳中和”——即碳排放与碳去除之间的平衡（Abanades等人，2017年；Pavan等人，2022年）。随着合成生物学的进步，将CO2转化为高附加值产品已成为一种有前景的解决方案（Lee等人，2025年）。这一策略不仅减少了温室气体排放（2023年的排放量超过了...），还有效地将CO2作为一种资源加以利用（Lee等人，2025年；Liu等人，2024年）。
Cupriavidus necator H16，以前被称为Ralstonia eutropha H16，是“Knallgas”细菌中的一个著名模式生物，这类细菌能够利用氢气（H2）和CO2进行生长（Pohlmann等人，2006年）。由于其多样的代谢能力和生物技术潜力，该菌株在近几十年里受到了广泛研究（Wang等人，2025年）。到目前为止，C. necator H16已被用作一个强大的微生物底盘，利用CO2作为唯一碳源，可持续生产各种高附加值化合物，包括可降解塑料、生物燃料、前体药物和食品添加剂（Wang等人，2025年）。尽管其遗传可操作性使其在碳中和生物制造中的应用具有吸引力，但由于某些代谢途径的复杂性以及对其代谢调控机制理解的不完全，某些高附加值化合物的生产仍然具有挑战性（Wang等人，2025年）。
萜类化合物由重复的异戊二烯单元组成，是具有重大工业和经济价值的天然化合物，在医药、香水和燃料领域有着广泛应用（Chen等人，2024a）。微生物细胞工厂为萜类化合物的生产提供了一种可持续且高效的方法（Klaus等人，2022年；Li等人，2024年）。在生物体内，萜类化合物的生物合成主要通过两条不同的代谢途径进行：在真核生物中占主导地位的甲羟戊酸（MVA）途径，从乙酰辅酶A开始；以及在原核生物中常见的2-C-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径，从丙酮酸和甘油醛-3-磷酸开始（Kant等人，2023年）。在C. necator H16中，已利用外源MVA途径和内源MEP途径实现了倍半萜类化合物α-胡莫伦和β-法尼烯的生物合成（Krieg等人，2018年；Milker和Holtmann，2021年）。具体而言，通过在C. necator中引入异源MVA途径和α-胡莫伦合成酶（ZSSI），分别在异养、自养和电自养条件下合成了α-胡莫伦，最大产量分别达到了9.4?mg/L、6.3?mg/L和10.8?mg/L（Krieg等人，2018年）。相比之下，β-法尼烯仅在异养条件下在C. necator H16中合成，引入MVA途径反而降低了产量。最终，通过利用内源MEP途径和异源β-法尼烯合成酶，并优化发酵条件，工程改造后的C. necator H16的β-法尼烯产量达到了5.4?mg/L（Milker & Holtmann，2021年）。这些研究表明C. necator H16在利用CO2进行萜类化合物生物合成方面的潜力。然而，由于C. necator H16的代谢途径和调控机制优化不足，从CO2生产倍半萜类化合物的效率仍然较低或甚至无法检测到。此外，C. necator H16产生的倍半萜类化合物种类也较为有限。
作为倍半萜类化合物，β-石竹烯与α-胡莫伦和β-法尼烯在结构上具有相似性。除了作为调味和香料添加剂外，它还是先进生物燃料合成的重要前体（Tsigoriyna等人，2024年）。在这项研究中，我们开发了一种可持续的生物工艺，利用C. necator H16将CO2转化为β-石竹烯。在构建生产菌株后，我们通过三个不同的模块研究了提高产量的策略：增强生物合成途径、改善辅因子的可用性和优化整体调控（图1）。通过比较转录组分析，阐明了产量提高的机制。这些策略的结合实施显著提高了异养和自养条件下的β-石竹烯产量。这些结果为开发基于C. necator H16的从CO2生产萜类化合物的平台提供了宝贵的见解。
菌株和质粒
本研究中使用的细菌菌株详见补充材料。C. necator H16和E. coli菌株分别在30?°C和37?°C的Luria-Bertani（LB）培养基上培养，用于遗传操作和接合。必要时，添加了以下浓度的抗生素：E. coli添加卡那霉素50??mg/L，C. necator添加卡那霉素200??mg/L；E. coli和C. necator添加氯霉素50??mg/L；C. necator H16添加庆大霉素20??mg/L。
基因序列和质粒构建
四个异源基因...
在C. Necator H16中合成β-石竹烯
在这项研究中，来自Artemisia annua的β-石竹烯合成酶基因qhs在C. necator H16中通过PBAD调控下表达，使用质粒p2MCBAD-qhs。该构建被引入野生型菌株和PHB缺陷菌株（C. necator H16ΔphaC1AB1），分别生成了CNEQ01和CNQ02，从而研究了PHB合成与β-石竹烯生产之间的关系（图2A）。接下来，比较了CNQ01和CNQ02的生长情况和β-石竹烯产量
结论
在这项研究中，我们利用C. necator H16作为微生物底盘，开发了一种可持续的生物工艺，将CO2转化为β-石竹烯。通过组合工程方法实现了成功的生物合成和产量的显著提升。此外，本研究首次确定了全局调节因子fnr作为C. necator H16中β-石竹烯生产的正向调节因子，并通过转录组分析提供了机制上的见解。据我们所知，这是...
CRediT作者贡献声明
唐若浩：撰写初稿、数据可视化、验证、监督、资源管理、项目实施、资金获取、数据管理。高旭敏：撰写初稿、数据可视化、验证、项目实施、数据分析、数据管理。戴存熙：数据验证、资源管理、项目实施、数据分析。范亚茹：数据验证、数据分析。马光泽：数据验证
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号22278233）、山东省自然科学基金（编号ZR2023QB137）以及山东省高等学校“青年创新团队计划（编号2022KJ167）的资助。
