《Bioresource Technology》：Single-step polydopamine-assisted immobilization of laccase on membranes for reusable biocatalytic degradation of emergent pollutants
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针对水环境中新兴药物污染物（如阿霉素DOX）的去除难题，研究人员开发了一种新颖的一步法聚多巴胺（PDA）辅助策略，将漆酶（LC）固定于聚偏氟乙烯（PVDF）等膜材料表面，用于构建可重复使用的生物催化剂。该方法在温和条件下（pH 5.5, 30°C, 30分钟）实现高效固定，所得固定化漆酶在pH和温度变化下表现出卓越的稳定性，在60次重复使用后仍保持60%以上的活性，并能在24小时内降解90%的DOX。该研究为开发可持续的酶法水处理工艺提供了简洁、高效且可扩展的解决方案。
论文解读
在当今世界，水环境污染是一个日益严峻的挑战，其中，来自制药、医疗和农业领域的“新兴污染物”（Emerging Contaminants）因其持久性和潜在生态毒性而备受关注。阿霉素（Doxorubicin, DOX）作为一种强效抗癌药物，广泛用于治疗多种恶性肿瘤。然而，其在使用后不可避免地进入水循环系统，即使浓度极低（纳克至微克/升），也具有细胞毒性、致突变性、致畸性和致癌性风险，对环境和人类健康构成严重威胁。传统的物理化学水处理方法难以彻底降解这类结构复杂的有机分子，因此，寻找高效、环保的降解技术迫在眉睫。
自然界中的“绿色催化剂”——漆酶（Laccase, LC），因其能氧化降解多种酚类、芳香族化合物和染料，被视为解决此类污染物的理想生物工具。然而，游离漆酶在实际应用中存在明显的短板：它对环境条件（如pH、温度）敏感，稳定性差，难以从反应体系中回收，且无法重复使用，这大大增加了使用成本，限制了其工业化应用。为了解决这些难题，科学家们通常采用“固定化”技术，将酶锚定在固体载体上，以提高其稳定性、可操作性和可重复利用性。但传统的固定化方法往往步骤繁琐，需要使用多种化学试剂，过程复杂，不利于大规模应用。有没有一种方法，既能简单高效地固定漆酶，又能赋予其优异的性能呢？
这正是发表在《Bioresource Technology》上的这项研究致力于回答的核心问题。研究人员来自巴西圣卡塔琳娜联邦大学，他们开发了一种创新的“一锅法”策略，巧妙地利用了多巴胺（Dopamine, DP）在漆酶催化下的自聚合特性。在这个过程中，漆酶不仅充当了催化多巴胺聚合形成聚多巴胺（Polydopamine, PDA）的“工程师”，同时也被自己催化生成的PDA“捕获”并牢固地固定在膜载体表面。这种一步到位的固定化方法，避免了多步骤处理和额外化学交联剂的使用，简化了工艺，更符合绿色化学的原则。
为了验证这一方法的有效性，研究人员系统地开展了一系列实验。他们首先优化了固定化条件，包括时间、漆酶浓度和多巴胺浓度。结果表明，在pH 5.5、30°C条件下反应30分钟，使用2 mg·mL-1漆酶和0.25 mg·mL-1多巴胺时，固定化效果最佳。他们使用了多种膜材料作为载体，包括聚偏氟乙烯（PVDF）、混合纤维素酯（Mixed Cellulose Esters）和聚醚砜（Polyethersulfone, PES）等，以评估该方法的普适性。
关键研究方法简述
研究主要采用了以下几种关键技术方法：首先，通过一锅法多巴胺聚合与漆酶自固定化技术，在单一反应步骤中同时完成PDA形成和酶固定。其次，利用扫描电子显微镜（SEM）和衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）对固定化前后的膜表面形貌和化学结构进行表征。再者，通过Brunauer–Emmett–Teller（BET）比表面积分析评估了不同膜材料的孔结构和表面积。在性能评估方面，采用分光光度法以ABTS（2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）为底物测定游离和固定化漆酶的活性、pH/温度稳定性、储存稳定性及重复使用性。最后，利用荧光分光光度法监测并评估了固定化漆酶生物催化剂对模型污染物阿霉素（DOX）的降解效率。
研究结果
3.1. 一锅法固定化过程
研究系统评估了固定化时间、漆酶浓度和多巴胺浓度对酶活性的影响。?1 and DP concentration of 1? mg·mL?1, B- effect of LC concentration at DP concentration of 1? mg·mL?1and 30?min, and C- effect of DP concentration at LC concentration of 2? mg·mL?1and 30?min.">结果表明，酶活性在30分钟时达到峰值，此后因持续聚合形成的PDA层可能包埋已固定的酶而导致活性下降。漆酶浓度从1 mg/mL增加到2 mg/mL时活性显著提升，但增至4 mg/mL时未见进一步增长，表明存在最佳酶负载量。有趣的是，较低的多巴胺浓度（0.25 mg·mL-1）反而更有利于保持高酶活性，这可能是因为过量的DP会干扰酶的功能位点。
3.2. pH和温度的影响
固定化显著拓宽了漆酶的适用pH范围。游离漆酶在pH 3时活性最高，但随pH升高急剧下降。而固定化漆酶在pH 3至6的范围内都保持了较高的相对活性，甚至在pH 6时仍保留了约42%的活性，这大大增强了其在接近中性环境中的应用潜力。在温度稳定性方面，固定化酶在30°C和50°C下处理8小时后，分别保留了约42%和39%的活性，表现出良好的操作稳定性。然而，在70°C高温下，酶在30分钟内迅速失活。
3.3. 储存与生物催化剂可重用性
储存条件对固定化漆酶的活性保持至关重要。在-20°C冷冻条件下储存21天后，酶活性仍能保持约60%，显著优于4°C冷藏和20°C室温储存。最令人印象深刻的是其可重用性：经过连续60次反应循环后，固定化漆酶仍能保持初始活性的60%以上，这远超许多文献报道的仅能重复使用8-12次的固定化体系，证明了该PDA固定化策略在赋予酶极强操作稳定性方面的卓越优势。
3.4. 动力学参数
通过Lineweaver-Burk图计算了Michaelis-Menten常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。固定化漆酶的Vmax（117.647 mM）低于游离酶（270.270 mM），表明其最大反应速率有所下降。同时，固定化酶的Km值（0.00843 mM）高于游离酶（0.00367 mM），意味着其对底物ABTS的亲和力有所降低。这些变化主要归因于固定化过程带来的扩散限制、空间位阻以及酶构象灵活性的降低。
3.5. 所开发生物催化剂的表征
通过SEM观察发现，原始PVDF膜表面光滑均一，而经过PDA和漆酶固定化处理后，膜表面变得粗糙、多孔且不均匀，出现了颗粒状结构，证实了PDA涂层和酶的成功负载。ATR-FTIR光谱分析进一步揭示了化学相互作用：PDA的引入带来了芳香族C=C和酚类基团的特征峰，而漆酶的固定则增强了O-H和N-H伸缩振动峰，证实了漆酶通过共价（如迈克尔加成、席夫碱反应）和非共价相互作用成功固定在PDA修饰的膜表面。
3.6. 所开发生物催化剂在阿霉素降解中的应用
性能验证实验表明，游离漆酶在4小时内几乎能100%降解DOX，而固定化漆酶在24小时内可降解约70%。当将膜用量加倍（即酶负载量加倍）时，24小时内的降解率提升至约90%。尽管固定化体系的初始降解速率因底物扩散限制而较慢，但其突出的可重复使用性和稳定性使其在连续流处理系统中更具应用价值。对照实验证实，DOX浓度的降低主要源于酶促降解而非膜的物理吸附。
3.7. 所开发方法在不同膜材料上的应用
该方法展现出良好的普适性。在测试的多种膜材料中，混合纤维素酯膜表现最佳，其固定化漆酶的绝对活性约为PVDF膜的3倍。这归因于纤维素酯膜亲水性强、表面富含羟基，更有利于PDA的均匀沉积和漆酶的有效固定。聚醚砜膜和陶瓷氧化铝膜也显示出可观的活性，而不同供应商的PVDF膜因表面结构和亲疏水性差异，表现有所不同。BET分析揭示了膜比表面积和孔结构对固定化效果的影响，但研究表明，膜的表面化学性质（亲水性、官能团）比单纯的比表面积对最终酶活性的影响更为关键。
研究结论与意义
本研究成功开发了一种简单、可持续的一步法固定化策略，利用漆酶催化多巴胺自聚合形成聚多巴胺，同时将漆酶自身高效地固定于膜载体上。该方法摒弃了复杂的多步偶联过程，操作简便。所制备的生物催化剂不仅保持了高催化效率，更在稳定性上实现了巨大突破：其在宽泛的pH和温度范围内表现稳定，尤其在重复使用性上优势明显，60次循环后活性保留超过60%。该催化剂能有效降解阿霉素等药物污染物，并在多种膜材料上均表现出良好性能，其中在纤维素酯膜上活性提升约3倍。
这项工作的意义在于，它提供了一种将绿色生物催化与先进材料工程相结合的创新方案。通过简化固定化工艺、减少化学品使用并大幅提升催化剂的耐用性，该技术为开发高效、经济且环境友好的酶法水处理系统铺平了道路。这种酶-材料杂化体系有望应用于污水处理厂、制药工业废水处理等场景，通过将分离与降解功能集成于一体，实现新兴污染物的持续去除，推动水资源管理和环境保护向更可持续的循环生物技术解决方案迈进。尽管该体系在实验室条件下展现出巨大潜力，但其长期稳定性、连续流操作性能、对更广谱污染物的降解能力以及工业化规模的经济可行性，仍是未来需要深入探索的方向。
