《Environmental and Experimental Botany》：Lichen Symbiotic Stress as a Precursor to Biodiversity Loss – Rapid Assessment Using
Evernia prunastri as a Bioindicator for Nitrogen Pollution
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本文聚焦于过量活性氮（Nr）污染对生态系统的威胁，并指出利用地衣作为Nr生物指示剂的现有研究多基于短期实验室实验或野外采样，缺乏能够隔离不同Nr水平长期影响的野外尺度实验证据。为此，研究人员以栎扁枝衣（Evernia prunastri）为模式生物，创新性地采用野外移植实验结合大尺度地理采样，通过测量其真菌细胞膜损伤（电解质电导率EC）和共生藻类叶绿素含量（F735/F700比值）等生理指标，探究了其在不同浓度氨气（NH3）暴露下的响应。研究结果表明，该地衣的组织氮含量在长期接触约2 μg m-3的NH3时会饱和于约1.3%，超出此阈值将导致不可逆的生理损伤。这一发现揭示了剂量-暴露时间的交互作用对地衣生理适应与损伤的关键影响，并证明了基于真菌膜损伤和藻类叶绿素含量变化的快速检测方法，可用于预警Nr污染引发的早期生态胁迫，为制定更精准的Nr排放临界水平和政策提供了直接依据。
自20世纪中期以来，由农业（NHx）和化石燃料燃烧（NOx）释放的过量大气活性氮（Nr）已成为全球生物多样性丧失和生态系统功能紊乱的主要驱动力。地衣，作为对氮污染最敏感的生物指示类群之一，被广泛用于监测和评估Nr的生态影响。传统研究方法主要依赖实验室短期高控制实验或野外物种丰度调查，这些方法虽然在理解功能响应与生态结果的联系上取得了进展，但一个关键的空白在于：缺乏能够在真实野外环境中，将地衣对特定Nr水平的长期响应进行隔离研究的实验数据。这限制了我们精准评估污染胁迫下地衣的生理适应极限和早期预警信号的能力。
为了填补这一空白，一项发表在《Environmental and Experimental Botany》的研究应运而生。研究团队以栎扁枝衣（Evernia prunastri）——一种常见且对氮敏感的地衣——作为模式生物，巧妙地设计了一个野外尺度实验。他们在苏格兰东南部的一片桦树林中，利用一套风控氨气（NH3）增强系统，创造了一个点源排放模拟环境。该系统可以产生一个浓度呈指数递减的NH3> 羽流，研究人员将地衣个体移植到距离氨气源5米、13米和32米的下风处，并设置了一个位于系统外、仅接受背景氨浓度（约0.67 μg m-3）的对照组。实验持续了12周，并在第6、13、32和83天对不同处理组的地衣进行采样。同时，为了验证实验结果在更广泛自然环境中的适用性，研究人员还在苏格兰和英格兰的13个地点采集了地衣样本，这些地点覆盖了不同的氨浓度梯度。通过测量地衣的相对生长率（RGR）、组织总氮（N）含量、评估真菌细胞膜损伤的电解质电导率（EC）以及作为藻类叶绿素含量（Chlorophyll content）指标的叶绿素荧光比（CFR）F735/F700，研究团队系统分析了不同剂量-暴露时间下地衣的生理响应。
研究者为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术方法：首先是野外移植与受控暴露实验，利用创新的风控氨气释放系统，在真实森林环境中创建了精确的NH3浓度梯度；其次是生理生化指标检测，通过测量地衣组织的电解质电导率来量化真菌细胞膜的损伤程度，并使用便携式叶绿素含量计测量F735/F700比值作为藻类叶绿素含量的快速代理指标；此外，通过元素分析仪测定地衣组织的总氮含量，并采用被动扩散采样器（ALPHA?） 精确监测实验位点的NH3浓度；研究还结合了大尺度地理采样，从不同污染背景的13个位点收集样本，以验证实验结果的普遍性；最后，运用统计分析（方差分析ANOVA、相关性分析及回归分析）来评估不同处理组间的差异以及各生理指标间的内在联系。
研究结果
1. 移植实验中的剂量与时间效应
实验结果显示，移植距离（即NH3浓度）和暴露持续时间及其交互作用，对地衣的相对生长率（RGR）、电解质电导率（EC）和组织总氮含量均有显著影响。在距离氨源最近的5米处（平均浓度约32.57 μg m-3），地衣RGR从暴露13天起急剧下降，最终在83天时全部死亡。而在13米（约11.51 μg m-3）和32米（约3.59 μg m-3）处，地衣虽然RGR为负值，但仍能存活至实验结束，表明部分适应。组织总氮含量在对照组（背景浓度）基本稳定在较低水平（0.36–0.59%），而在暴露组中随距离减小和暴露时间延长而显著增加，表明地衣不断吸收并积累氮。电解质电导率在实验初期（6天内）所有处理组均有所下降，随后在暴露组中随时间和浓度增加而持续上升，表明真菌细胞膜损伤加剧。叶绿素含量（CFR）主要受暴露时间影响，在13米和32米处的中后期显著增加，提示藻类可能通过上调光合作用来适应氮胁迫。
2. 生理指标间的关联
相关性分析揭示，在移植实验中，地衣RGR与组织总氮含量（r = -0.39）和电解质电导率（r = -0.63）均呈显著负相关。这表明组织氮积累和真菌细胞膜损伤是导致生长率下降的关键因素。线性回归分析进一步证实了这些负相关关系。叶绿素含量与RGR无显著相关，但与总氮含量呈显著正相关（r = 0.70），表明在中低氮胁迫下，藻类可能通过增加叶绿素来尝试适应。
3. 地理采样结果的验证
对来自13个不同氨浓度背景站点的地衣样本分析表明，组织总氮含量随大气NH3浓度增加而升高，但在浓度超过约1.5 μg m-3后趋于饱和，饱和值约为1.3%。叶绿素含量与大气NH3浓度呈显著线性正相关。然而，电解质电导率在野外样本中与氨浓度没有明确关系，研究者认为这是因为持续高电导率（指示严重膜损伤）是死亡的前兆，因此在现存种群中很难采集到此类个体，这恰恰验证了实验结论——高氮胁迫导致地衣死亡和局地种群消失。值得注意的是，在采样区域，当模型预测的长期平均NH3浓度超过约2 μg m-3时，便无法找到存活的栎扁枝衣。
研究结论与意义
本研究通过创新的野外控制实验与广泛的地理采样相结合，明确了地衣栎扁枝衣对氨气（NH3）胁迫的响应机制，揭示了剂量与暴露时间的交互作用是决定其命运的关键。研究发现，地衣组织氮含量在长期暴露于约2 μg m-3的NH3时达到饱和（约1.3%）。在此阈值之下，地衣可能通过增加藻类叶绿素含量等机制进行部分生理适应；然而，持续暴露会导致真菌细胞膜损伤（表现为电解质电导率升高）不断累积，最终破坏共生平衡，导致生长停滞乃至个体死亡。该研究验证了利用真菌细胞膜损伤和藻类叶绿素含量这两个易于快速测量的生理指标，可以作为预警氮污染对地衣造成早期胁迫的有效工具。这为在物种丧失和群落变化发生之前，识别并干预氮污染引发的生态风险提供了新思路。更重要的是，研究结果对现有的氮污染临界水平（目前设定为1 μg m-3）提出了新的见解，指出即使是低于此水平的长时期暴露也可能引发地衣的适应性响应，而长期暴露于≥2 μg m-3的环境则极可能导致敏感物种（如栎扁枝衣）的局部灭绝。这项研究不仅深化了我们对氮污染生态效应的机理认识，也为利用生物指示剂进行环境监测和政策制定（如设定更精准的临界负荷）提供了直接、可靠的实验证据。
