《Food Bioscience》：Construction of an antibiotic marker-free
Bacillus subtilis host via genome editing and secretion of a hyperthermostable β-galactosidase through signal peptides screening
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通过CRISPR-Cpf1技术构建安全的枯草芽孢杆菌分泌菌株BS801，筛选出SPdacB信号肽实现BgaS高效分泌，其乳糖水解率达92.64%，在90℃、pH7.0条件下仍保持高活性。
郭志豪|徐慧东|张赫|吴小哲|聂子深|李成杰|伊琳娜·德利多维奇|周静文|夏宇
中国江南大学食品科学与技术学院食品科学与技术国家重点实验室，无锡214122
摘要
β-半乳糖苷酶对于生产低乳糖牛奶至关重要。然而，大多数商用酶是嗜温的，不适合高温处理；而另一些酶的最佳pH值偏酸，与牛奶接近中性的pH值不兼容。来自Pyrococcus furiosus的耐热β-半乳糖苷酶BgaS具有潜力，因为其最佳温度为90°C，pH值为7.0。但由于其在非食品安全系统中的异源表达受到限制，且其分泌表达尚未得到充分研究。本研究通过CRISPR-Cpf1介导的无痕敲除技术，从高分泌效率的宿主WB800中敲除了3个抗生素抗性基因ble、hyg、bsr，构建了一种食品安全的Bacillus subtilis菌株BS801，并发现培养后基因编辑效率有所提高。BgaS在BS801中实现了异源表达，通过筛选10种Sec途径信号肽（SPs）优化了其分泌表达。其中4种SPs有效促进了BgaS的分泌，其中蛋白DacB的信号肽（SPdacB）的分泌效率最高，细胞外酶活性达到0.42 U/mL。重组BgaS在80°C下孵育3小时后相对活性仍保持约80%。值得注意的是，该酶在90°C下4小时内可将原始牛奶中的乳糖水解至浓度低于0.5%（w/w），乳糖水解率达到了92.64%。这些结果表明，BS801菌株分泌的BgaS在乳制品工业中具有很好的应用潜力。
引言
β-半乳糖苷酶在乳制品工业中对于生产低乳糖牛奶起着关键作用。然而，大多数市售的β-半乳糖苷酶是嗜温的，最佳反应温度范围为35至70°C（Gutierrez等人，2025年），因此无法承受高于70°C的高温杀菌过程（Arsalan等人，2020年；Lin等人，2018年）。因此，必须在牛奶冷却后添加这种酶进行反应。这一限制增加了工业生产过程中的微生物污染风险（Griep-Moyer等人，2022年）。另一种策略是使用适应低温的乳糖酶在低温下降解乳糖，但这需要分步骤进行巴氏杀菌和乳糖水解，导致工艺更加复杂。此外，许多商用β-半乳糖苷酶的最佳pH值偏酸（Shaikh等人，1999年；Zerva等人，2021年），与牛奶接近中性的pH值不兼容。因此，发现和研究具有中性最佳pH值的耐热β-半乳糖苷酶在乳制品工业中具有重大价值。
先前的研究已经指出，来自Pyrococcus furiosus的β-半乳糖苷酶BgaS是一个有前景的候选酶，因为它具有较高的热稳定性。例如，BgaS的最佳反应温度为90°C或更高，在80°C下孵育4小时后仍能保留超过80%的酶活性（Dong等人，2014年）。此外，其最佳pH值7.0与牛奶的pH值非常接近。然而，在以往的研究中，BgaS的异源表达主要在E. coli中进行（D?abrowski等人，2000年；Dong等人，2014年）。由于E. coli具有产生毒素的能力，这引发了食品安全问题，在食品工业中是不可接受的（Movahedpour等人，2022年）。另外，由于Pyrococcus furiosus的BgaS是一种胞内酶，关于其分泌表达的报道很少，进一步限制了其工业应用潜力。
为了利用BgaS的优势特性并克服上述限制，选择一个具有强大蛋白质分泌能力的食品安全表达宿主至关重要。Bacillus subtilis是一种被广泛认可的GRAS（Generally Recognized as Safe）表达宿主（Yang等人，2016年）。该物种及其衍生物具有增强的蛋白质分泌能力（Gu等人，2018年；Xiang等人，2020年），并且拥有多种分泌途径和全面的信号肽系统，使其在蛋白质表达和分泌方面具有优势（Chen等人，2016年；Degering等人，2010年）。先前的研究表明，尤其是属于B. subtilis Sec途径的信号肽具有最高的分泌效率（Brockmeier等人，2006年；Duan & Luan，2023年）。例如，改良的高性能宿主菌株B. subtilis WB800表现出优异的分泌能力（S.-C. Wu等人，2002年）。然而，在构建过程中引入了三个外源抗生素抗性基因，这对工业应用存在安全风险。随着CRISPR基因编辑技术在B. subtilis中的应用，现在可以构建出无痕且食品安全的菌株用于工业用途（Y. Wu, Liu等人，2020年；Y. Wu, Chen等人，2020年）。
在这项工作中，选择了来自P. furiosus的β-半乳糖苷酶BgaS在B. subtilis中进行分泌表达。基于B. subtilis WB800，使用CRISPR-Cpf1基因编辑系统无痕敲除了外源抗性基因，构建了一种食品安全的B. subtilis表达宿主BS801。随后通过信号肽筛选研究了BgaS在BS801中的分泌表达，进一步降低了生产成本和潜在的安全风险。结果表明，这种食品安全菌株能够有效分泌BgaS，乳糖水解数据表明其在乳制品加工中具有很高的应用潜力。
菌株、质粒和材料
本研究使用的质粒、菌株和引物列在表S1中。质粒pMA5-Lip和pMA5-MCS之前已在本实验室构建并保存。Bacillus subtilis WB800菌株保存在本实验室，其衍生菌株也在此研究中构建。质粒pXHD1.1及其用于BgaS异源表达和信号肽筛选的衍生质粒也是在本研究中构建的。质粒pHT-XCR6用于Cpf1蛋白表达
CRISPR-Cpf1辅助删除三个抗性标记基因
为了验证pHT-XCR6的阳性转化子，从构建的重组菌株WB800(pHT-XCR6)中提取质粒并进行琼脂糖凝胶电泳验证，结果见图S3。质粒pHT-XR6的大小接近理论值14,002 bp，表明质粒已成功导入细胞，重组菌株WB800(pHT-XCR6)已成功构建。
为了从WB800菌株中删除抗性基因ble
结论
总之，通过CRISPR-Cpf1基因编辑系统，以B.subtilis WB800菌株为原始宿主，成功构建了一种具有高分泌能力和无抗性标记的新重组菌株BS801。BgaS在BS801中成功表达。重组BgaS的最佳反应温度为90°C，最佳pH值为7.0。同时，该酶还具有良好的耐热性，其相对活性几乎保持不变
CRediT作者贡献声明
吴小哲：数据验证、数据管理。张赫：实验研究、数据分析。李成杰：写作、审稿与编辑。聂子深：软件开发、数据分析。周静文：写作、审稿与编辑。伊琳娜·德利多维奇：写作、审稿与编辑。夏宇：写作、审稿与编辑、资源协调、项目管理、资金争取、概念构思。郭志豪：初稿撰写、方法设计、实验研究、数据分析、数据管理。徐慧东：初稿撰写
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（2021YFE0101800）的支持。
