可溶性多糖对靛蓝物理性质的调控作用：提升其对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制效果

《Food Bioscience》：Regulation of Indigo's Physical Properties by Soluble Polysaccharides to Enhance Its Biofilm Inhibitory Efficiency against Staphylococcus aureus

本研究发现吲哚通过超声处理减小颗粒尺寸抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，与可溶性多糖形成的复合物显著增强抗菌活性（提高4倍以上），为开发高效植物源抗菌剂提供理论依据。

　　

Jingfan Han|Jiajun Huang|Pinhuang Luo|Kewei Liu|Donghe Jiang|Jiajun Hu|Min-Tian Gao

上海大学生命科学学院生物能源作物重点实验室，中国上海上大路99号，200444

摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）能够附着在多种表面上并聚集形成生物膜。靛蓝是一种从植物中提取的生物活性物质，能够抑制金黄色葡萄球菌的生物膜形成。本研究探讨了靛蓝抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的机制，并提出了一种增强靛蓝抗菌效果的新方法。靛蓝并未抑制金黄色葡萄球菌的生长，但显著抑制了其生物膜的形成。在含有靛蓝的培养液中可以观察到细菌的聚集现象。靛蓝降低了细胞外基质（EMs）的荧光强度，并导致其颜色略微偏蓝。通过超声波处理减小靛蓝颗粒的大小，有效增强了其对生物膜形成的抑制作用。统计分析显示，颗粒大小与生物膜量呈正相关（皮尔逊相关系数=0.847，p <0.01）。基于这一抑制机制，选择可溶性多糖（SPs）作为分散剂，制备了高度稳定的靛蓝-SP复合物。红外光谱分析表明，该复合物中的N-H氨基发生了变化，表明靛蓝与SPs可能通过氢键相互作用。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，靛蓝-SP复合物中的小颗粒比例高于未经处理的靛蓝。值得注意的是，该复合物的抗菌活性比未经处理的靛蓝提高了4倍以上。本研究为开发高效且安全的植物源抗菌剂提供了理论和技术支持。

引言

在自然界中，细菌主要以两种形式存在：自由生活的浮游状态或附着在表面的生物膜（Liu等人，2024）。它们通常会形成生物膜以更好地适应外部环境的变化，几乎所有细菌都能形成生物膜（Zhao等人，2023）。生物膜本质上是受群体感应系统调控的三维生物聚集体（Zhao等人，2022）。生物膜由细菌本身及其分泌的细胞外基质（EMs）组成，包括胞外多糖、细胞外蛋白质和细胞外DNA等关键成分（Kang等人，2023；Kranjec等人，2021）。生物膜的形成不仅增强了细菌对外部环境的适应性（Wang等人，2022），还提高了它们对抗生素的抵抗力（Sharma等人，2023）。

金黄色葡萄球菌是一种临床上重要的革兰氏阳性细菌病原体（Wang & Lee，2024）。这种细菌存在于人类和其他动物的皮肤微生物群中，在健康人群中的携带率为20-30%（Ahmad-Mansour等人，2021）。金黄色葡萄球菌可引起多种疾病，包括皮肤感染（Yamazaki等人，2024）、脓肿（Lei等人，2023）、坏死性肺炎（Ensinck等人，2021）、心内膜炎（Tong等人，2015）和骨髓炎（Chen等人，2023）。值得注意的是，金黄色葡萄球菌的生物膜特别善于附着在宿主体内的异物上（Zhang等人，2021），导致植入式心脏设备、血管导管和人工关节等医疗假体的污染（Lu等人，2024）。耐抗生素疾病每年导致超过1000万人死亡，预计到2050年这一数字将超过癌症相关死亡人数（Parums，2024）。由于传统抗生素的效果不佳，寻找新的治疗策略变得迫切（Sun等人，2021）。

除了抗生素外，其他天然化合物也表现出抗菌生物膜活性（Mzid等人，2017）。近年来，研究人员提出使用植物提取物作为有效的未来抗菌生物膜疗法（Song等人，2022）。不同的精油和植物提取物被用来抑制和分散金黄色葡萄球菌的生物膜（Bazargani & Rohloff，2016）。植物提取物也与抗生素结合使用来对抗金黄色葡萄球菌的生物膜。例如，从孜然中提取的茴香醛与环丙沙星联合使用，对金黄色葡萄球菌的生物膜显示出协同抗菌作用（Das等人，2024；Monteiro-Neto等人，2020）。因此，药用植物是发现病原体生物膜抑制剂的重要来源（Cheng, Yao等人，2024）。

Strobilanthes cusia（Nees）Kuntze是一种属于爵床科（Acanthaceae）的多年生草本植物，在东亚和东南亚广泛分布（Pamungkas等人，2023），在中国西南部、南部和东部也有广泛种植（Cheng等人，2020）。靛蓝是Strobilanthes cusia中的关键活性成分，具有抗炎、抗癌和抗氧化特性，在医学上得到了广泛应用（Cheng, Chen等人，2024；Grieve等人，2006）。靛蓝具有独特的 conjugated 结构，包含两个羰基和两个亚氨基。氧原子和氮原子带有部分负电荷，使其能够形成氢键或静电相互作用。这些特性使其能够特异性地与细胞膜的脂质双层（疏水核心）和膜蛋白（极性/亲水区域）相互作用。然而，靛蓝分子中的 conjugate 双键和极性基团（如羰基）使得靛蓝颗粒容易通过范德华力和氢键发生物理聚集，从而减少了靛蓝与细胞之间的相互作用（Hu等人，2023）。我们认为，修改靛蓝颗粒的表面性质对于提高其生物活性具有重要意义（Li等人，2023）。

本研究探讨了改变靛蓝物理性质对其影响生物膜形成能力的作用。使用可溶性多糖（SPs）作为分散剂，探索了它们在改变靛蓝物理性质中的作用。颗粒大小和稳定性被认为是决定靛蓝抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的关键因素，从而为优化靛蓝的抗菌应用提供了新的见解。此外，通过球磨法制备了高度稳定的靛蓝-SP复合物，有效缓解了靛蓝的水溶性差和生物利用度低的问题，提高了其抗菌效果，为基于靛蓝的抗菌材料的发展提供了方法论基础。

主要试剂

实验中使用的所有化学物质和溶剂均为分析级。SYTO 9绿色荧光核酸染料（SYTO 9）购自Thermo Fisher Scientific Inc.（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。Luria-Bertani（LB）肉汤培养基购自Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）。靛蓝和乙腈购自上海Macklin生化科技有限公司（中国上海）。葡聚糖购自上海RAWN生化科技有限公司（中国上海）。

靛蓝对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响

向生物膜培养基中加入靛蓝溶液后，葡萄糖消耗和醋酸盐的产生均未发生变化，表明靛蓝对金黄色葡萄球菌的生长没有显著的抑制作用（图1A）。这一结果与Cheng等人（2024）的发现一致，他们的扫描电子显微镜（SEM）观察表明，靛蓝无法穿透细菌细胞内部，而是吸附在细胞之间。

结论

本研究探讨了靛蓝抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成的机制。靛蓝的结晶度和颗粒大小是影响生物膜形成的关键因素。降低靛蓝的结晶度和颗粒大小增强了其与细胞外基质的结合，最终抑制了生物膜的形成。基于靛蓝与微生物细胞外基质之间的特异性结合机制，结合使用物理球磨法和SPs作为分散剂，制备了高度稳定的靛蓝-SP复合物。

CRediT作者贡献声明

Min-Tian Gao：撰写 – 审稿与编辑、监督、方法学、资金获取、概念化。Jiajun Hu：撰写 – 审稿与编辑、方法学、概念化。Donghe Jiang：撰写 – 审稿与编辑、方法学。Pinhuang Luo：撰写 – 审稿与编辑、方法学。Kewei Liu：撰写 – 审稿与编辑、方法学。Jiajun Huang：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、方法学、概念化。Jingfan Han：撰写 – 审稿与编辑、撰写 –

未引用的参考文献

Cheng等人，2024年。

利益冲突

作者确认他们与本手稿描述的工作没有利益冲突。

伦理批准

不需要。

序列信息

不适用。

资助

作者感谢国家重点研发计划（2021YFE0192600）和国家自然科学基金（32071640、51878646、22131044）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的利益冲突或个人关系。

缩写

EMs

细胞外基质

IN

靛蓝

INM

研磨后的靛蓝

INSPM

靛蓝-SP复合物

LB

Luria-Bertani

PBS

磷酸盐缓冲盐水

TPLSM

双光子激光扫描显微镜

XRD

X射线衍射

SEM

扫描电子显微镜

SPs

可溶性多糖

SYTO 9

SYTO 9绿色荧光核酸染料