《Food Chemistry》：Natural sugar substitute Rebaudioside M: Efficient and cost-effective biosynthesis via host engineering, cascade biocatalysis, and substrate feeding
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宿主工程与级联催化策略显著提升Rebaudioside M生物合成效率，通过表达宿主优化酶基因增强溶胞率至92%，结合蔗糖合成酶实现UDP-葡萄糖再生，采用补料分批策略使产物浓度达28.38 g/L且转化率91.6%。
罗翔|王阳|周曼|孙巧兰|王雪|余晓杰|陈莉|杨华|周存山
中国江苏省镇江市江苏大学食品与生物工程学院，邮编212013
摘要
雷鲍迪苷M是一种理想的零热量甜味剂，但其天然含量较低，限制了其工业应用。本文通过宿主工程、级联生物催化和底物添加技术，提高了雷鲍迪苷D的酶法转化效率。在真核宿主中表达糖基转移酶后，可溶性酶的比例从18%提高到了92%，比细菌系统提高了1.46倍。结合蔗糖合成酶的使用，实现了从廉价蔗糖原位再生糖供体的目标。动力学分析表明，底物耗尽是批次反应中的主要瓶颈。采用补料批次法后，产品浓度达到28.38克/升，转化率高达91.6%，比批次法提高了3.99倍。这一综合策略为下一代天然甜味剂的高效生产提供了实用基础。
引言
随着代谢性疾病的增加，对具有更好感官特性的天然无热量甜味剂的需求也在增加（Lim等人，2025年；Wang等人，2025年）。在从Stevia rebaudiana中提取的斯蒂维醇苷类化合物中，雷鲍迪苷M（Reb M）因其类似蔗糖的口感和极低的苦味而特别受到青睐（Wang等人，2023年）。然而，其极低的天然含量严重限制了其直接提取和大规模应用。
因此，利用Stevia rebaudiana中的UDP依赖性糖基转移酶76G1（UGT76G1）将更丰富的雷鲍迪苷D（Reb D）转化为Reb M成为了一种实用的替代方法（Wang, Luo, Zhou, Yu, Chen等人，2026年）。迄今为止，大多数报道的Reb M生物合成平台都依赖于在大肠杆菌（E. coli）中异源表达UGT76G1，因为大肠杆菌具有遗传操作简便和生长迅速的特点（Shu等人，2020年；Wang, Sun等人，2021年；Wu等人，2020年）。然而，UGT76G1是一种植物来源的真核酶，在E. coli中的表达常常伴随着溶解度降低、包涵体形成以及催化稳定性下降，导致功能性活性酶的比例较低（Wang, Liu等人，2021年）。这些限制影响了制备级反应中的催化效率和操作稳定性。
在这种情况下，Pichia pastoris（P. pastoris）作为一种有前景的异源表达平台脱颖而出，因为它能提供适合真核酶折叠的环境，从而可能提高酶的质量（Liu等人，2022年；Pan等人，2022年）。尽管如此，关于UGT76G1在原核和真核宿主中表达的系统性研究仍然较少。因此，选择合适的宿主进行Reb M生物催化仍主要基于经验，而宿主对酶性质的影响如何转化为级联效率、动力学行为和工艺可扩展性尚不明确。
同时，UDP-葡萄糖的高成本也是UGT76G1介导的Reb M生产中的另一个主要瓶颈。为了减少对辅因子的依赖，人们采用了基于蔗糖合成酶（SuSy）的再生策略，从廉价蔗糖中回收UDP-葡萄糖，从而提高了糖基化过程的经济可行性（Bachosz等人，2023年；Schm?lzer等人，2016年）。然而，UGT–SuSy级联系统的性能仍受到酶之间兼容性、功能稳定性和长时间运行期间底物可用性的显著影响。
基于这些考虑，本研究探讨了在P. pastoris中表达UGT76G1是否比在E. coli中具有优势，以及这些宿主依赖性差异是否可以用于提高UGT76G1–蔗糖合成酶级联反应中的Reb M产量。系统比较了两种宿主中表达的UGT76G1的溶解度、催化性质和稳定性，并建立了体外双酶级联系统以实现从蔗糖原位再生UDP-葡萄糖。这些发现将宿主依赖性的酶质量与级联性能联系起来，支持了基于宿主的Reb M生物合成优化策略。
部分内容摘录
菌株、质粒和材料
本研究使用的细菌菌株和质粒列于表S1中。E. coli DH5α用于质粒构建和扩增，而E. coli BL21 (DE3)和P. pastoris GS115作为目标酶的异源表达宿主。编码UGT76G1（T284S/M88L/L200A变体；GenBank Q6VAB4）和来自Glycine max（GmSuSy；NP_001237525）的蔗糖合成酶的基因经过密码子优化，以便在E. coli和P. pastoris中表达（NovoPro；//www.novoprolabs.com/tools/codon-optimization构建表达UGT76G1的重组E. coli和P. pastoris菌株
为了评估不同宿主对UGT76G1表达和催化性能的影响，该酶在E. coli BL21 (DE3)和P. pastoris GS115中进行了表达。相应的表达载体分别为E. coli的pRSF-UGT76G1和P. pastoris的pPICZ-UGT76G1，如图1a所示。两种宿主中的转化和表达过程总结在图1b中。P. pastoris系统中的多个转化子能够在高Zeocin选择压力下生长
结论
总之，通过整合宿主选择、UDP-葡萄糖再生和底物管理，提高了从Reb D酶法生产Reb M的效率。与E. coli相比，在P. pastoris中表达UGT76G1显著提高了可溶性酶的比例（从18%提高到92%），并增强了催化能力，具体表现为比活性提高了1.46倍，催化效率（kcat/Km）提高了1.8倍。将UGT76G1与GmSuSy结合使用后，实现了从蔗糖原位再生UDP-葡萄糖。
CRediT作者贡献声明
罗翔：撰写——初稿撰写、可视化、验证、方法学设计、实验设计、数据分析、概念构思。王阳：撰写——审稿与编辑、验证、方法学设计、实验设计、数据分析。周曼：撰写——审稿与编辑、数据分析。孙巧兰：数据验证。王雪：数据验证。余晓杰：项目监督、项目管理、概念构思。陈莉：撰写——审稿与编辑。杨华：撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（22378175）和江苏省现代农业关键研发计划（BE2023344）的支持。
