《Food Chemistry: X》：Unraveling volatile and microbial dynamics of Pukeng tea with different storage times using metabolomics, chemometrics, and microbiome analysis
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本文推荐：为探究传统后发酵黑茶——蒲坑茶(PKT)长期储藏后风味演变的科学机制，研究人员首次采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC–MS)代谢组学、化学计量学(如主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA))和微生物组分析(基于16S rRNA和ITS扩增子测序)相结合的策略，对3-20年不同储藏期的蒲坑茶样本进行了整合研究。研究发现，储藏时间显著塑造了蒲坑茶的挥发性物质谱和微生物群落结构，鉴定出包括1-丁醇、1-戊烯-3-醇在内的46种差异挥发性物质，并揭示了优势微生物（如葡萄球菌属(Staphylococcus）、糖多孢菌属(Saccharopolyspora）、曲霉属(Aspergillus））与这些关键香气活性物质的显著关联。该研究首次系统阐明了蒲坑茶在长期储藏过程中的化学与微生物动态变化，为理解其风味形成机制、产品真伪鉴别、质量控制及功能性微生物筛选提供了重要科学依据。
茶是世界范围内广泛消费的非酒精饮料，不仅因其感官品质，也因其促进健康的功效而备受珍视。在六大茶类中，黑茶以其“后发酵”工艺和适合长期储藏的特性而闻名，在储藏过程中会发生复杂的生化反应和微生物转化，形成包括挥发性化合物在内的多种代谢物，从而形成其独特风味。然而，对于某些地方特色黑茶，其长期储藏过程中的具体化学和微生物变化仍是一个有待深入探索的“黑箱”。蒲坑茶(PKT)就是这样一个例子，它主要产自中国广东省清远市清新区的石潭镇，作为地理标志产品，具有重要的生态、经济和文化遗产价值。当地社区认为长期储藏对于塑造蒲坑茶的风味和功能品质至关重要，常见储藏年限可达3、5、8、10、15甚至20年。尽管饮用历史悠久，但关于蒲坑茶的科学研究却极为匮乏，其化学组成和微生物生态的动态变化一直不甚清晰。挥发性化合物是茶叶香气和风味的关键贡献者，而微生物活性在茶叶长期储藏期间对品质塑造起着关键作用。将微生物组分析与代谢组学相结合，是阐明微生物类群与风味代谢物之间关联的有效策略。为了填补这一知识空白，理解蒲坑茶长期储藏背后的风味形成机制，并为这一传统产品的品质控制和可持续发展提供科学支撑，一项整合多组学技术的深入研究势在必行。
本研究应用了多项关键技术来系统探究蒲坑茶的挥发性物质和微生物动态。首先，采集了储藏3、5、8、10、15及20年的蒲坑茶样本。其次，采用顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用(HS-SPME-GC–MS)技术进行非靶向代谢组学分析，全面鉴定和定量了样本中的挥发性化合物。再次，运用化学计量学方法，如主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，来解析不同储藏年限样本之间的挥发性物质差异并筛选关键差异代谢物。最后，通过高通量扩增子测序技术，分别针对细菌的V5-V7区域（使用799F和1193R引物）和真菌的ITS区域（使用ITS1F和ITS2引物）进行测序，以剖析样本中的微生物群落结构。此外，研究还利用相关性分析（如皮尔逊相关和冗余分析(RDA)）来探索微生物类群与挥发性物质之间的潜在关联。
3.1. 不同储藏年限蒲坑茶中的挥发性物质动态
通过HS-SPME-GC–MS分析，研究在蒲坑茶样本中鉴定出189种挥发性化合物，归属于13个化学类别，包括醇类(31种)、酮类(26种)、醛类(17种)等，揭示了陈年蒲坑茶香气的复杂化学基础。在类别水平上，醇类(34.29–45.25%)、醛类(8.01–16.61%)、呋喃类(4.76–8.08%)、酮类(5.31–8.08%)和杂环化合物(1.63–4.64%)是丰度最高的五类。其中，醇类在所有样本中均占主导地位，并在PKT20（储藏20年）中达到峰值45.25%；醛类在中期储藏（PKT10）相对丰度较高；呋喃类和酮类在PKT8中丰度最高；杂环化合物在早期样本（PKT3）中最为突出；而单萜类在长期储藏的样本（如PKT10、PKT15、PKT20）中更为丰富。这些动态变化反映了持续的生化转化过程，塑造了蒲坑茶不断演变的香气谱。在个体化合物水平上，最丰富的挥发性物质包括1-戊烯-3-醇(3.35–22.64%)、1-丁醇(2.90–30.04%)、己醛(2.80–6.84%)等。值得注意的是，1-戊烯-3-醇在较新的茶中（PKT5）最为丰富，而在PKT20中降至3.35%；相反，1-丁醇从PKT8的2.91%显著增加到PKT20的30.04%。主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)的得分图均显示，不同储藏年限的蒲坑茶样本在挥发性物质组成上存在清晰分离，表明储藏时间对挥发性物质组成有显著影响，且储藏时间越长，分化越明显。
3.2. 长期储藏期间蒲坑茶中的差异挥发性化合物
为了识别能显著区分不同储藏年限蒲坑茶的关键挥发性物质，研究采用了一种结合PLS-DA模型的变量重要性投影(VIP)得分和方差分析(ANOVA)的化学计量学策略。最终鉴定出46种关键差异代谢物，主要为醇类、醛类和酮类。其中，1-丁醇的判别性最强，VIP值为8.32，其次是1-戊烯-3-醇(7.77)、己醛(6.50)和1-己醇(5.98)。通过热图可视化这些差异挥发性物质的相对丰度动态，发现一些化合物（如1-戊烯-3-醇、顺式-2-戊烯醇和1-戊烯-3-酮）的相对丰度随着储藏年限增加呈下降趋势，这些物质通常赋予青草、绿色或蘑菇样香气。相反，另一些化合物（如1-甲氧基-2-丙醇、1-丁醇、苯甲酸和柠檬烯）则总体呈上升趋势。还有一些物质（如对乙基愈创木酚、1-甲基环庚醇、2-庚酮和3-蒈烯）呈现复杂的波动模式。这首次系统地鉴定了不同储藏年限蒲坑茶中的差异挥发性物质，它们不仅为样本间的挥发性物质差异提供了化学解释，也可作为鉴别特定储藏年限蒲坑茶产品的潜在生物标志物。
3.3. 蒲坑茶样本中的微生物群落动态
微生物多样性分析显示，细菌和真菌的稀疏曲线均随测序深度增加而趋于饱和，表明测序深度足以捕获群落中的大多数微生物多样性。在门水平上，共鉴定出7个细菌门，其中放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)在所有样本中均占主导地位，合计占总细菌群落的89.36–99.65%。在早期储藏阶段（3-8年），群落主要由厚壁菌门(56.92–77.83%)组成，而放线菌门占比较小(21.82–42.45%)。随着储藏时间延长，放线菌门显著增加，在PKT10、PKT15和PKT20中超过60%，而厚壁菌门则下降至13.05–29.25%。在属水平上，共注释出133个细菌属，其中11个为优势属（相对丰度>1%）。葡萄球菌属(Staphylococcus)在早期阶段占主导地位，但在后期（如PKT20）急剧下降至0.01%。糖多孢菌属(Saccharopolyspora)在所有蒲坑茶样本中均相对丰富(6.44–31.90%)，在PKT10达到峰值。红球菌属(Rhodococcus)和Sciscionella属在不同样本间波动明显，其最高相对丰度分别在PKT20达到19.58%和22.97%。土杆菌属(Turicibacter)在储藏时间少于20年的蒲坑茶中未被检出，但在PKT20中显著出现，相对丰度达18.97%。与细菌群落相比，真菌群落的多样性在门和属水平上都显著较低。仅鉴定出两个真菌门：子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)，其中子囊菌门在所有蒲坑茶样本中占绝对优势（>99%）。共注释出110个真菌属，所有样本均被曲霉属(Aspergillus)主导(87.76–99.27%)。进一步在物种水平分析，揭示了包括嗜干曲霉(A. penicillioides)、大麦曲霉(A. hordei)、红曲霉(A. ruber)和局限曲霉(A. restrictus)在内的几种优势物种。这是首次表征蒲坑茶样本的微生物群落及其随储藏时间的动态变化。
3.4. 微生物群落与挥发性物质组成之间的关联
为探索蒲坑茶中微生物与挥发性物质之间可能的关系，研究基于不同储藏年限下微生物和挥发性代谢物的动态变化计算了皮尔逊相关系数。结果显示，特定微生物类群与挥发性化合物之间存在正向和负向关联。葡萄球菌属(Staphylococcus)与超过一半的挥发性物质（如醇类的1-戊烯-3-醇、1-戊醇、二氯乙醇，醚类的2,3-二甲基苯甲醚、1,3-二甲氧基苯，以及杂环化合物如甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪等）呈强正相关。糖多孢菌属(Saccharopolyspora)与己醛、庚醛、2-己烯醛和二氢猕猴桃内酯等挥发性物质呈正相关，而与甲基吡嗪、1,3-二甲氧基苯等化合物呈负相关。红球菌属(Rhodococcus)、Sciscionella属和土杆菌属(Turicibacter)在挥发性物质产生方面表现出相似的关联模式，它们促进了1-甲基环庚醇、1-丁醇、乙苯和苯甲酸等代谢物的产生。芽孢杆菌属(Bacillus)、嗜盐放线菌属(Actinopolyspora)和新草螺菌属(Noviherbaspirillum)则表现出另一种关联模式，它们与反式-3-己烯醇、1-辛烯-3-醇和松油烯等呈正相关。此外，唯一的优势真菌属曲霉属(Aspergillus)也与多种挥发性物质（如2-甲基丁醛、2,3-二甲基苯甲醚）的生产表现出强相关性。为进一步验证皮尔逊相关分析的结果，研究还进行了冗余分析(RDA)。RDA排序图揭示了储藏期间微生物演替与挥发性物质谱之间的清晰关联，主要微生物属的定位总体上支持了热图中观察到的相关性模式。这些互补性分析表明，微生物群落动态共同驱动了蒲坑茶储藏期间挥发性物质的演化。
本研究首次整合HS-SPME-GC–MS非靶向代谢组学、化学计量学和微生物组分析，对储藏3-20年的蒲坑茶的挥发性物质和微生物谱进行了全面分析。研究发现，储藏时间显著塑造了蒲坑茶的化学和微生物特征。在挥发性物质方面，鉴定出189种化合物，其中46种（如1-丁醇和1-戊烯-3-醇）被确定为区分不同储藏年限的潜在生物标志物。在微生物方面，早期储藏样本以厚壁菌门（特别是葡萄球菌属）为主，而长期储藏导致放线菌门（包括糖多孢菌属、红球菌属、Sciscionella属和土杆菌属）丰度增加。真菌群落多样性较低，主要由曲霉属绝对主导，其中几个物种可能作为功能性贡献者。相关性分析揭示了关键微生物属（如葡萄球菌属、糖多孢菌属、红球菌属）与香气活性挥发性物质（如1-丁醇、1-戊烯-3-醇、己醛）之间复杂的正负关联，凸显了微生物对蒲坑茶风味演变的贡献。这些发现增进了对不同储藏年限蒲坑茶化学和微生物多样性的理解，为产品真伪鉴别、质量控制和功能性微生物发现提供了有价值的标记物。此外，该研究展示了结合代谢组学、微生物组分析和化学计量学来探索传统发酵茶中代谢物-微生物相互作用的有效性，从而支持其可持续发展和工业应用。
