解析avenanthramides对淀粉葡萄糖苷酶的抑制机制：通过多光谱技术、酶动力学和分子对接模拟进行研究

《Food Chemistry》：Unraveling the inhibition mechanism of avenanthramides on amyloglucosidase: Probing by multi-spectroscopic techniques, enzyme kinetics, and molecular docking simulations

燕麦中的avenanthramides（AVNs）通过竞争性主导混合机制抑制α-淀粉酶，其中AVC抑制活性最强（IC50 2.4 mg/mL），结合光谱与分子模拟证实其诱导酶构象变化，为开发功能性降糖食品提供依据。

　　

冯文娟|吴迪|施雅宁|张涛|金正宇|苗明

江南大学食品科学与资源国家重点实验室，中国无锡214122

摘要

本研究探讨了燕麦中的阿魏酸酰胺（AVNs）抑制淀粉葡萄糖苷酶的潜力。阿魏酸酰胺C（AVC，IC?? 2.4 mg/mL）表现出最强的抑制作用，其次是阿魏酸酰胺A（AVA，IC?? 2.9 mg/mL）和阿魏酸酰胺B（AVB，IC?? 4.4 mg/mL）。AVNs通过一种竞争性主导的混合类型机制抑制淀粉葡萄糖苷酶。这种竞争性机制可以通过AVN在催化中心附近结合，诱导构象变化，从而减小活性位点的体积并阻断底物结合来解释。分子动力学模拟证实了复合物的稳定性，MMGBSA表明AVC的结合亲和力最高（?43.9 kcal/mol），其次是AVB（?32.5 kcal/mol）和AVA（?25.2 kcal/mol）。荧光猝灭实验证实了静态结合以及配体诱导的荧光位移，表明了酶的构象变化。圆二色光谱进一步显示，AVNs引起了结构改变，在低温范围内促进蛋白质 unfolding，而在高温下则抑制这种过程。这些发现支持燕麦作为天然淀粉葡萄糖苷酶抑制剂的来源，可用于开发旨在控制血糖的功能性食品。

引言

随着经济和社会的发展，不良的生活习惯，如久坐不动和高糖饮食，导致了包括葡萄糖代谢紊乱及相关疾病在内的健康问题日益严重（Egan & Dinneen, 2019）。控制餐后血清葡萄糖峰值是管理餐后高血糖的关键策略（Le et al., 2024; Nsor-Atindana et al., 2019）。淀粉被唾液和胰腺中的α-淀粉酶水解为麦芽糖、麦芽三糖和α-极限糊精，然后被肠上皮表面的α-葡萄糖苷酶进一步分解释放葡萄糖，抑制这些酶可以减缓淀粉消化和餐后高血糖（O'Keefe & Bell, 2007）。阿卡波糖和伏格列波糖等药物通过抑制α-淀粉酶来限制碳水化合物代谢，被广泛用于2型糖尿病的治疗（Dong et al., 2022）。然而，长期使用这些药物常常会引起严重的胃肠道副作用，如腹泻、胀气和胃痛。相比之下，最近的研究表明植物次生代谢物如多酚和黄酮类化合物能有效抑制这些酶（Proen?a et al., 2022）。与酵母α-葡萄糖苷酶不同，后者对淀粉及其初步水解产物的活性有限，而来自黑曲霉的淀粉葡萄糖苷酶可以直接将它们水解为葡萄糖，使其成为更符合人体生理学的α-葡萄糖苷酶替代物。体外消化模型使用猪胰腺α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶协同作用，将淀粉分为快速可消化（RDS，0–20分钟）、缓慢可消化（SDS，20–120分钟）和抗性（RS，>120分钟）组分（Englyst et al., 1992; Zhou et al., 2021）。该模型中的RDS值与体内血糖反应有很强的相关性（r = 0.82，p < 0.001）（Englyst, 1999），为评估淀粉消化提供了可靠的平台。因此，阐明多酚对淀粉葡萄糖苷酶的抑制作用对于准确模拟人类淀粉消化过程和制定调节策略至关重要。

燕麦富含生物活性化合物，如独特的酚酰胺类化合物——阿魏酸酰胺（AVNs；0.55–775.50 mg/kg），其结构基于羟基肉桂酸和蒽酸衍生物的酰胺连接（Yu et al., 2022）。我们之前的研究表明，发芽可以调节AVNs代谢酶的活性，从而增加燕麦中AVNs的积累（Wu et al., 2023）。已在燕麦籽粒和营养组织中鉴定出25种以上的阿魏酸酰胺同类物（Collins, 1989）。Jágr等人（2020）报告称，AVA、AVB和AVC占总AVNs的65–70%；这三种类似物具有相同的咖啡酸-蒽酸核心结构，仅在苯甲酸环的5位位置有所不同，分别含有H（AVA）、OH（AVB）或OCH?（AVC）。研究表明，摄入从燕麦中提取的AVNs可以减少体重增加、氧化应激和炎症，并调节高脂饮食小鼠的肠道微生物群（Zhang et al., 2020）。然而，AVNs对淀粉葡萄糖苷酶的抑制机制及其作为天然降糖剂的潜力仍不清楚。我们假设不同的AVNs对淀粉葡萄糖苷酶的抑制作用存在差异，可能会产生不同的降糖效果，并揭示新的靶点或机制。

在这项研究中，我们调查了燕麦中不同亚类的AVNs对酶的抑制活性，以评估它们在控制餐后血糖方面的潜在作用。研究针对的是固态燕麦淀粉中的淀粉葡萄糖苷酶，这样可以最大限度地减少淀粉-AVN复合物对酶抑制机制的影响。通过酶抑制测定、荧光猝灭、圆二色光谱以及分子对接和分子动力学模拟探讨了淀粉葡萄糖苷酶与AVNs之间的相互作用。这些结果为开发富含AVNs的燕麦产品以辅助餐后血糖管理奠定了基础。

材料

通用实验室试剂（AR级）从中国上海的Sinopharm Chemical Reagent Co.购买。脱落酸（ABA，天然，≥90%）从中国上海的Yuanye Biotechnology Co.购买。芦丁、没食子酸和抗坏血酸（Asc）的分析标准品从中国上海的Macklin Biochemical Co.购买。淀粉葡萄糖苷酶（来自黑曲霉，≥260 U/mL）以及咖啡酸（CA）、阿魏酸（FA）、p-香豆酸（PC）、AVA、AVB、AVC的分析标准品也从该公司购买。

AVNs对淀粉葡萄糖苷酶的抑制效果

在进行全面的抑制分析之前，首先评估了主要多酚的抑制效果。具体来说，我们研究了主要AVNs（AVA、AVB和AVC）及其相应的酚酸前体（AVA的咖啡酸、AVB的阿魏酸和AVC的p-香豆酸）对淀粉葡萄糖苷酶的抑制作用。如图1所示，所有测试化合物都表现出剂量依赖性的淀粉葡萄糖苷酶活性抑制作用。IC₅₀值分别为

结论

淀粉葡萄糖苷酶是体外分析淀粉消化过程中的一种关键酶。根据本研究的结果，从发芽燕麦中提取的阿魏酸酰胺（AVNs）被证实是有效的天然淀粉葡萄糖苷酶抑制剂。抑制作用通过一种混合类型机制实现，该机制由酶活性位点内的自发结合驱动。光谱和计算机模拟分析证实，AVNs会导致酶结构发生构象变化，并通过这种变化与其相互作用。

CRediT作者贡献声明

冯文娟：撰写——原始稿件、方法学、数据分析。吴迪：撰写——原始稿件、实验设计、数据分析。施雅宁：撰写——审稿与编辑、可视化、结果验证、监督。张涛：撰写——审稿与编辑、监督、概念构思。金正宇：结果验证、方法学、实验设计。苗明：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、概念构思。

未引用的参考文献

Deng, Bian, Luo, Liu and Hu, 2023

Englyst, Veenstra and Hudson, 1996

Kothawala, Murphy, Stedmon, Weyhenmeyer and Tranvik, 2013

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFF1100101）、国家自然科学基金（31972029）、中国“****”青年顶尖人才项目以及江苏省科技支撑计划（BE2020308）的财政支持。