在体外结合模型中，评估亚甲蓝（methemoglobin）和聚合亚甲蓝（polymerized methemoglobin）对氰化物（cyanide）、叠氮化物（azide）和硫化物（sulfide）的解毒作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Evaluation of methemoglobin and polymerized methemoglobin for detoxification of cyanide, azide, and sulfide in in vitro binding models

该研究通过体外模型评估甲氧血红蛋白（methHb）及其氧化聚合物形式metPolyhHb对氰化物、叠氮化物和硫化物的广谱解毒能力，发现氧化后的聚合物血红蛋白（metPolyhHb）在保持分子大小和结构完整性的前提下，能有效结合三种毒素，为开发新型多效解毒平台提供依据。

　　

格里芬·J·贝耶（Griffin J. Beyer）|阿西姆·汗（Asim Khan）|坦梅伊·萨尔维（Tanmay Salvi）|安德烈·F·帕尔默（Andre F. Palmer）

威廉·G·洛里（William G. Lowrie）美国俄亥俄州哥伦布市俄亥俄州立大学化学与生物分子工程系

摘要

氰化物、叠氮化物和硫化物是作用迅速的细胞毒素，它们通过靶向关键酶中的金属中心来抑制线粒体呼吸，导致能量迅速耗尽并可能引发致命的代谢崩溃。尽管这些物质在临床上具有重要意义，但能够广泛中和这些有毒阴离子的特异性解毒剂仍然有限。高铁血红蛋白（methHb）是一种对这类配体具有高亲和力的血红蛋白铁形式，已被认为是一种能够在有毒阴离子到达线粒体目标之前将其隔离的解毒剂。聚合血红蛋白（PolyhHb）及其氧化形式——聚合高铁血红蛋白（metPolyhHb）为提高基于methHb的解毒系统的稳定性、循环时间和安全性提供了一种有前景的策略。在这项研究中，我们使用体外结合模型对methHb和metPolyhB进行了多配体清除能力的表征。高效液相色谱（HPLC）和动态光散射（DLS）实验表明，PolyhHb的氧化不会改变其分子大小或分布。圆二色性分析证实氧化后其二级结构得以保持。通过紫外-可见光谱和停流动力学实验，我们发现methHb和metPolyHb能够快速有效地结合氰化物、叠氮化物和硫化物。这些发现表明，PolyhHb在氧化后仍保持结构完整性，并对多种有毒阴离子具有强大的解毒能力，这支持了其作为广谱解毒剂开发平台的潜力。

引言

氰化物、叠氮化物和硫化物是在工业、环境和临床环境中常见的剧毒阴离子。它们在制造、实验室过程、采矿、农业和废物处理中都有应用，但当人类通过吸入、摄入或皮肤吸收时，都可能引发迅速而严重的中毒[1]、[2]、[3]、[4]。氰化物广泛用于金属电镀、塑料合成和熏蒸；而肼酸和无机叠氮化物则是推进剂、起爆剂和生物合成试剂的重要组成部分[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。硫化物在石化加工、废水系统和腐烂的有机物中产生，常以硫化氢气体的形式在密闭空间中积聚[11]、[12]。尽管来源不同，但这些化合物的暴露往往是意外的，发生在火灾、工业故障、污水系统或实验室事故等情况下[2]、[3]、[6]、[7]、[8]、[12]。包括自杀企图在内的故意暴露也增加了它们的临床重要性。

尽管在化学性质上有所不同，氰化物、叠氮化物和硫化物具有共同的中毒机制：它们都靶向对有氧能量产生至关重要的金属蛋白。氰化物以高亲和力与细胞色素c氧化酶中的三价铁（Fe³⁺结合，从而阻断线粒体复合物IV中的电子传递[5]、[6]、[7]、[13]。叠氮化物同样抑制细胞色素c氧化酶，并与过氧化氢酶和其他含血红素的酶相互作用，进一步加剧代谢紊乱[8]、[9]、[10]。硫化物无论是自由形式还是质子化形式，都会通过与细胞色素c氧化酶中的血红素中心形成强复合物以及可逆地抑制琥珀酸脱氢酶来阻止氧化磷酸化[11]、[12]。通过破坏线粒体呼吸，这些阴离子会导致细胞能量突然丧失，进而引发乳酸酸中毒、癫痫发作、心血管衰竭和死亡。由于症状发展迅速且治疗窗口狭窄，因此快速有效的解毒策略对于防止不可逆的神经损伤和死亡至关重要。

目前的解毒方法有限，且主要针对氰化物设计。羟钴胺（hydroxocobalamin）被批准用于氰化物治疗，其作用机制是通过与氰化物结合形成氰钴胺，但其疗效受到血浆蛋白结合力和配体特异性的限制[14]、[15]。基于亚硝酸盐的疗法与硫代硫酸盐联合使用，通过将红细胞（RBCs）内的血红蛋白（hHb）氧化为高铁血红蛋白（methHb），从而将氰化物从细胞色素c氧化酶中分离出来，并促进氰化物转化为硫氰酸盐[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]。然而，亚硝酸盐的使用会降低红细胞携带氧气的能力，需要密切监测以避免危险的 methemoglobinemia[22]、[23]。此外，亚硝酸盐疗法并不能直接解决叠氮化物或硫化物引起的中毒问题，尽管它们的作用机制与氰化物中毒相似[8]、[11]、[12]、[16]。缺乏能够快速中和这三种有毒阴离子的广谱解毒剂仍然是临床上的一个重大空白。

methHb 本身由于其含有的铁血红素而具有吸引人的解毒潜力，因为它能强烈结合氰化物、叠氮化物和硫化物[19]、[20]、[21]。然而，未经修饰的（无细胞）methHb 和 hHb 衍生物在体内的循环效果较差，半衰期短，并可能引起肾脏毒性[24]、[25]、[26]。为了解决这些问题，铃木等人（Suzuki等人）探索了脂质体包裹的 methHb 和 methHb-白蛋白簇[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。他们在体外模型、心肌细胞模型和小鼠模型中证明了这两种构建体能够有效结合并中和氰化物、叠氮化物和硫化物[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。除了这些策略外，聚合血红蛋白（PolyhHb）也显示出潜力，相比天然 hHb，它具有更好的胶体稳定性、更低的肾脏过滤率和更长的循环时间[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]、[41]、[42]。PolyhHb 的氧化会产生聚合高铁血红蛋白（metPolyHb），后者可能作为一种多配体阴离子毒素清除剂，而不会产生亚硝酸盐引起的天然 hHb 氧化所带来的副作用。这样的系统理论上可以提供快速解毒，同时避免低氧血症，减少脱靶毒性，并将解毒作用扩展到氰化物以外的叠氮化物和硫化物。

在这项研究中，我们评估了 methHb 和 metPolyHb 作为氰化物、叠氮化物和硫化物的广谱清除剂的能力。通过生化、生物物理和动力学分析，我们评估了聚合和随后的氧化过程是否能够保持结构完整性和配体结合能力。这些发现旨在确立 metPolyHb 作为开发下一代解毒剂的可行平台，以中和多种快速作用的线粒体毒素。

材料

戊二醛（C?H?O?）（25 wt%）、氰硼氢化钠（NaCNBH?）和硫代硫酸钠（Na?S?O?）购自 Sigma-Aldrich（密苏里州圣路易斯）。磷酸一钠（NaH?PO?）、磷酸二钠（Na?HPO?）、氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）和氢氧化钠（NaOH）购自 Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。氰化钾（K?FeCN?）、氰化钾（KCN）和亚硝酸钠（NaNO?）以及其他所有化学品均购自 Fisher Scientific。

结果与讨论

表1全面总结了 hHb、T态 PolyhHb、R态 PolyhHb 及其相应金属形式的生物物理和生化特性。表格包括了SEC测得的分子量估计值、DLS测得的流体力学直径、结合血红蛋白的动力学参数、热稳定性（Tm）以及氰化物、叠氮化物和硫化物的结合参数。

结论

这些发现全面评估了 hHb 的氧化状态和聚合过程对氰化物、叠氮化物和硫化物吸附能力的影响。铁血红蛋白和铁血红蛋白衍生物的结合分析表明，铁血红素含量是有效捕获配体的决定性因素。铁血红蛋白以及 T态和 R态的 PolyhHb 对这三种阴离子的结合能力都微乎其微，证实聚合本身并不能赋予清除能力。

CRediT 作者贡献声明

格里芬·J·贝耶（Griffin J. Beyer）：撰写原始草稿、方法论设计、实验实施、概念构思。阿西姆·汗（Asim Khan）：撰写原始草稿、方法论设计、实验实施、概念构思。坦梅伊·萨尔维（Tanmay Salvi）：实验实施。安德烈·F·帕尔默（Andre F. Palmer）：撰写修订稿、资源协调、资金获取、概念构思。

资金信息

本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的资助，项目编号为 R01HL156526 和 R01HL174012。

利益冲突声明

A.F.P. 是美国专利 US20250019418A1 的发明人，该专利描述了使用 met-PolyhHb 衍生物清除有毒阴离子的方法。

致谢

我们衷心感谢俄亥俄州立大学化学与生物分子工程系的生物物理相互作用与表征设施（BICF）提供的 CD 光谱仪，以及该校化学与生物化学系的聚合物合成研究设施提供的 Malvern Zetasizer DLS 设备。