大气冷等离子体诱导的虾过敏原精氨酸激酶二级结构变化

《International Journal of Biological Macromolecules》：Atmospheric cold plasma-induced secondary structure modifications of shrimp allergen arginine kinase

白对虾过敏原arginine kinase（AK）经冷等离子体处理后，其二级结构发生显著改变，包括α螺旋减少3-7%、β折叠增加7-19%，处理时间越长和越直接暴露变化越明显，为非热加工降低过敏原潜力提供依据。

　　

李培文|莫森·加瓦希安|陈春荣|黄彦杰|张志芬|陈宇国|余旭生

台湾屏东科技大学食品科学系，屏东91201

摘要

精氨酸激酶（AK）是一种关键的虾类过敏原，对敏感个体存在相当大的健康风险。尽管人们越来越意识到食物过敏是一个公共卫生问题，但了解新兴加工技术对虾类过敏原的影响已成为一个重要的研究课题。本研究评估了针板介电屏障放电大气冷等离子体对从白虾（Litopenaeus vannamei）中纯化的AK二级结构的影响。等离子体直接应用于纯化的AK溶液，或在蛋白质纯化前应用于虾肌肉。所有样品和未经处理的对照组均通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行二级结构分析。酰胺区域光谱显示出了可测量的变化，包括α-螺旋减少了3-7%，β-折叠增加了7-19%，β-转角和无规卷曲分别减少了1-4%和3-8%。较长的等离子体暴露时间（10分钟对比5分钟）导致这些变化更为显著。此外，直接处理纯化蛋白比先对虾肌肉进行等离子体处理产生的变化更为明显。研究结果表明，等离子体能够非热地改变虾AK的二级结构，并为未来研究结构变化如何影响过敏原稳定性和免疫反应性奠定了基础。

引言

流行病学调查显示，虾类过敏影响了相当比例的过敏成年人，这凸显了其临床和公共卫生意义[1]。在已知的虾类过敏原中，原肌球蛋白被认为是主要过敏原，而精氨酸激酶（AK）被认为是第二大过敏原。AK最早在21世纪初在Penaeus monodon（Pen m 2）和Litopenaeus vannamei（Lit v 2）中被发现，并自此被视为与原肌球蛋白同样重要的临床相关过敏原[2],[3]。值得注意的是，根据血清IgE结合试验，AK在高达51%的虾类过敏患者中可引起IgE反应[4]。功能上，AK是一种位于甲壳类肌肉中的磷酸原激酶，它通过将高能磷酸基团从精氨酸可逆转移到ADP上来维持细胞内ATP水平。结构上，它是一种由约356个氨基酸组成的水溶性蛋白质，分子量为40-45 kDa[5]。AK的过敏原特性与其天然构象密切相关，因为IgE的识别主要针对构象表位。据报道，破坏AK的折叠会降低IgE结合活性[6],[7]。

已经研究了多种加工技术，包括热处理、酶解和高压处理，以降低虾蛋白的致敏性[8]。尽管这些方法可以改变蛋白质结构并降低IgE结合能力，但它们通常会导致营养价值、质地或感官属性的不利变化。最近，大气冷等离子体作为一种非热处理方法出现，能够生成与蛋白质相互作用并引起构象变化的活性物种[9]。研究表明，等离子体处理可以改变食品蛋白质的二级结构，从而降低其致敏潜力[11],[12]。关于虾类过敏原的研究主要集中在原肌球蛋白上，发现等离子体处理后其结构和免疫反应性发生了显著变化[13]。然而，尽管AK被认为是第二大具有强临床相关性的虾类过敏原，但对其影响的研究却很少。为填补这一空白，本研究旨在探讨大气冷等离子体如何影响虾AK的二级结构。

蛋白质的二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲构象组成，这些构象通过氢键稳定，并与蛋白质的折叠和稳定性密切相关[14],[15]。这一层面的结构变化可以影响分子相互作用并改变生物功能[16]。对于食物过敏原而言，结构稳定的蛋白质往往能够抵抗胃肠道降解，从而保持IgE结合活性[17]。特别是β-折叠结构与强烈的IgE亲和力相关，这会促进过敏反应。α-螺旋和β-折叠含量的变化也可能影响抗原呈递细胞（APCs）的识别和处理，从而影响T细胞激活和随后的免疫反应[18]。这些观察表明，二级结构与过敏原的稳定性和免疫原性直接相关，结构改变可以改变蛋白质的致敏潜力。

然而，尽管虾类过敏原很重要，且非热技术在海鲜加工中的应用也越来越广泛，但专门研究这些技术对虾AK影响的研究仍然有限。以往关于虾类过敏原的大气冷等离子体处理的研究主要集中在原肌球蛋白上[19],[20],[21],[22]。相比之下，尽管AK被认为是第二大虾类过敏原，但在与等离子体相关的过敏原研究中受到的关注相对较少。原肌球蛋白在甲壳类过敏原研究中的主导地位主要是由于其在虾肌肉中作为主要肌纤维蛋白的高相对丰度和结构稳定性，这导致大多数基于等离子体的研究都集中在其免疫反应性上。然而，AK是一种酶类过敏原，具有独特的结构和物理化学性质，其对冷等离子体技术的反应不能仅从原肌球蛋白推断出来。据我们所知，尚未有研究使用FTIR等光谱方法系统地检查等离子体引起的虾AK的二级结构变化。

因此，本研究旨在探讨介电屏障放电（DBD）大气冷等离子体对虾AK二级结构的影响。采用了两种方法：直接对纯化的AK溶液进行5分钟或10分钟的等离子体处理（APAK5, APAK10），以及在AK纯化前对虾肌肉进行5分钟或10分钟的等离子体处理（APsm5, APsm10）。这种设计使得能够在蛋白质和组织层面比较结构变化，为理解DBD等离子体如何改变虾AK的构象提供了依据。

实验部分

虾样本

新鲜的白脚虾（Litopenaeus vannamei）从台湾屏东的当地市场购买，并在冷藏条件下运输到实验室进行后续实验。

粗提AK提取物的制备

根据Chen等人的方法[23]对白脚虾中的AK进行提取，并进行了少量修改。手动去除虾的头、尾、壳、肠静脉和结缔组织，然后将其匀浆得到虾肉。将虾肉与20 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）混合

大气冷等离子体处理前纯化AK的表征

SDS-PAGE和Western blot用于评估大气冷等离子体处理前的AK纯度。如图1a所示，从离子交换色谱中收集的组分（泳道29、30、34、35、38、40、42和43）的SDS-PAGE分析显示出一个大约40 kDa的主要蛋白质条带，这与AK的预期分子量一致。图1b使用商业抗AK抗体进行了Western blot分析，通过检测到强信号确认了该蛋白质的身份

讨论

专门研究DBD大气冷等离子体引起的虾AK二级结构变化的研究仍然有限。以往关于等离子体辅助处理的研究主要集中在原肌球蛋白或植物和乳制品蛋白质上[13]。鉴于AK是第二重要的临床相关虾类过敏原，本研究提供了关于其结构对等离子体暴露敏感性的新见解。在本研究中，选择了5-10分钟的处理时间

结论

本研究表明，DBD大气冷等离子体显著改变了虾AK的二级结构，表明非热食品加工技术能够降低食物致敏性。FTIR显示α-螺旋显著减少，同时β-折叠增加，β-转角和无规卷曲减少。10分钟处理后的结构变化比5分钟处理后更为明显，且当纯化的AK直接暴露于等离子体时变化更为显著

作者贡献声明

李培文：撰写——原始草稿，研究，正式分析。莫森·加瓦希安：监督，资源，方法学。陈春荣：资源，方法学，正式分析。黄彦杰：可视化，研究，数据管理。张志芬：数据管理。陈宇国：监督。余旭生：撰写——审阅与编辑，概念化。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢屏东科技大学和台湾国家科学技术委员会（NSTC 112-2221-E-020-005-）的财政支持。作者还感谢TechMax Technical Co., Ltd.（台湾）在STA-DSC分析方面提供的技术协助。