《Cancer Treatment and Research Communications》：Reference materials and External Quality Assessment for Liquid Biopsy assays: Expert Opinions from the European Liquid Biopsy Society ctDNA Workshop
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随着液体活检在癌症临床决策中的重要性日益凸显，如何确保其检测结果的准确性与标准化成为关键挑战。本刊特推荐《Cancer Treatment and Research Communications》近期发表的由ELBS主办的专家研讨会共识。该研究系统探讨了ctDNA检测所需参考物质的理想特征、外部质量评估（EQA）应涵盖的关键变异类型与临床场景，旨在为检测方法的标准化、性能验证和质量控制提供权威指导，以最终提升液体活检在临床实践中的可靠性。
在精准医疗的时代，肿瘤治疗越来越依赖于对肿瘤基因变异的精准识别。传统的组织活检虽为“金标准”，但其侵入性、取样困难和难以实时监测等局限，促使了液体活检这一无创替代方案的蓬勃发展。其中，对血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）的分析，已成为监测肿瘤基因图谱、指导靶向治疗和评估疗效的有力工具。然而，这项前沿技术在步入常规临床应用的路上，正面临着一道必须跨越的门槛：如何确保不同实验室、不同检测平台得出的结果是准确、可靠且可比的？就像一个精密的秤需要标准砝码来校准一样，ctDNA检测也需要高质量的“标尺”——参考物质和严格的外部质量评估（EQA）体系来确保其质量。目前，业界对于什么样的参考物质最理想、EQA应该评估哪些内容缺乏共识，这成为了制约液体活检标准化和临床信任的关键瓶颈。
为此，欧洲液体活检学会（ELBS）于2023年召集了来自分子病理学、临床肿瘤学、基因组科学、EQA专业和诊断开发领域的44位顶尖专家，举办了一场关于ctDNA检测中参考物质与EQA的专题研讨会。这场研讨会通过专题报告、互动讨论和问卷调查的形式，汇集了专家们的实践经验与核心诉求。其成果旨在为行业提供清晰的指引，推动建立更统一、更严谨的质量控制标准，最终确保基于液体活检的临床决策能够真正惠及患者。相关共识已发表在《Cancer Treatment and Research Communications》期刊上。
为了形成这些共识，研讨会主要采用了基于证据的专家研讨与问卷调查方法。专家们通过投票和讨论，就参考物质的特征、EQA方案的设计等关键议题达成共识，相关结果以图表形式进行总结归纳。
研究结果主要分为参考物质和外部质量评估（EQA）两大部分。
参考物质
专家们首先探讨了用于验证检测方法的参考物质的类型与特征。调查显示，大多数专家使用商业化的参考物质（71.4%），也有相当比例使用自制的、来源于细胞系DNA或合成寡核苷酸“掺入”血浆的材料。重要的是，专家们一致认为，理想的参考物质应尽可能模拟真实患者样本的生物化学特性。其中，cfDNA的片段大小分布（120-220 bp）和模态片段长度（～166 bp）被视为最重要的特征。此外，参考物质应提供一系列不同的变异等位基因频率（VAF），其野生型背景DNA应具有全基因组复杂性，推荐使用“瓶中基因组”（Genome in a Bottle, GIAB）这类经过充分表征的标准品。
在分析方法验证的关键参数上，专家们达成了高度一致。为了准确确定检测的95%检测限（LoD
95），需要使用具有精确已知等位基因频率的参考物质，并制备
三到五个连续稀释梯度，重点覆盖0.1%至1%这一临床相关的VAF范围。同时，评估时还应纳入不同的cfDNA上样量（如10 ng 对 50 ng）以检验方法的稳健性。对于空白限（LoB，即背景噪音水平）的评估，绝大多数专家（97.1%）认为其优先级甚至高于灵敏度，并倾向于联合使用健康供体样本和野生型参考物质进行评估。专家们还强调，在验证内部开发的检测方法时，应将参考物质与临床样本结合使用（94.3%），并且倾向于使用一个能涵盖多种变异类型（如单核苷酸变异SNV、插入缺失indel、结构变异、拷贝数变异SCNA）的综合性参考物质，而非仅针对特定热点或基因的单一材料。
外部质量评估（EQA）
在EQA应涵盖的变异范围方面，专家们针对不同癌症类型给出了具体建议。对于非小细胞肺癌（NSCLC），应包含所有临床相关的EGFR基因变异（如外显子19缺失、密码子858、790、719、797热点突变及外显子20插入），以及KRAS密码子12和13的突变。此外，还应纳入与临床指南一致的其他可操作生物标志物，如ALK、ROS1、BRAF、RET融合，以及TP53、KEAP1、ERBB2（SCNAs）、STK11、PIK3CA、MET外显子14跳跃突变和非密码子600的BRAF突变。对于结直肠癌（CRC），专家一致认为必须包含KRAS密码子12和13，并强烈支持纳入NRAS密码子12、13以及BRAF突变。随着泛癌种治疗的发展，专家们也支持在泛癌种EQA中加入PIK3CA、ESR1、BRCA1、BRCA2、TP53等基因的SNV和Indel，以及NTRK1/2/3、FGFR、ROS1、ALK、RET等基因融合的检测。
关于EQA的设计格式，专家们强调其材料应模拟cfDNA的生物学特性，并包含临床相关VAF范围内的多种遗传变异。鉴于当前EQA常使用较高的VAF（1-10%），而临床实践中ctDNA的VAF常≤1%，因此共识认为EQA应纳入更低水平（如0.5-1%）的VAF以更好反映真实情况。对于融合和拷贝数变异（CNA）的检测，考虑到ctDNA检测对融合的敏感性较低，多数专家（67.9%）倾向于EQA设计采用DNA与RNA结合的策略。同时，专家们一致认为应将SCNA纳入EQA。此外，EQA应扩展至非小细胞肺癌和结直肠癌之外的癌种，优先考虑乳腺癌、前列腺癌和原发灶不明癌症（CUP）。关键的检测适应症应包括：监测耐药突变、组织不可用时，以及检测耐药变异。最后，为确保高质量的临床报告，EQA应评估实验室报告的多个要素，包括基因分型准确性、VAF报告、检测细节、局限性说明、cfDNA总量、临床解读等。
本研究总结的专家研讨会共识，为ctDNA检测的标准化和质量控制提供了清晰的路线图。核心结论是，高质量的参考物质和全面的EQA方案对于确保液体活检的准确性、可重复性和临床可靠性至关重要。理想的参考物质应高度模拟临床cfDNA的特性，并提供涵盖低VAF（如0.1%-1%）的连续稀释系列，用于精确确定检测限（LoD）和空白限（LoB）。同时，EQA方案需要与时俱进，不仅涵盖非小细胞肺癌和结直肠癌中的关键突变，还应扩展至泛癌种，包含更多可操作的生物标志物如基因融合和拷贝数变异（CNA），并纳入反映真实临床场景的低VAF样本和复杂变异。此外，EQA应超越简单的变异检出，评估实验室的全面报告能力，包括基因分型、VAF、检测局限性和临床解读等。最终，EQA的双重核心目的是评估测试服务质量，并通过案例分享和最佳实践交流促进持续的教育与改进。这项工作的意义在于，它将分散的专家经验凝聚成可操作的共识，为诊断开发商、EQA提供者、实验室和监管机构提供了共同遵循的框架，有望推动全球范围内ctDNA检测的标准化进程，从而提升液体活检在癌症精准医疗中的整体质量与可信度，最终使患者受益于更可靠、更一致的检测结果。
