《Cancer Treatment and Research Communications》：Preliminary evaluation of Chidamide in combination with novel [177Lu]Lu-DOTAGA-Rituximab in Rituximab-resistant Raji cells
编辑推荐：
为解决利妥昔单抗（Rituximab）耐药B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中CD20表达下调导致靶向放射免疫治疗（RIT）效果受限的难题，本研究探讨了组蛋白去乙酰化酶抑制剂西达本胺（Chidamide）上调CD20表达的潜力，并将其与新型放射免疫偶联物[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab联合应用于耐药Raji细胞。结果显示，西达本胺可增强利妥昔单抗-血清混合物的细胞毒性，且成功合成的[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab具有高纯度与良好稳定性，与西达本胺联用可显著提高对耐药细胞的杀伤效果。这项概念验证研究为克服利妥昔单抗耐药提供了新的联合治疗思路，具有转化为临床应用的潜力。
在癌症治疗的武器库中，靶向CD20的“生物导弹”利妥昔单抗（Rituximab）曾是B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-cell non-Hodgkin lymphoma, B-NHL）治疗的一场革命。然而，如同许多靶向药物一样，狡猾的癌细胞会发展出耐药性，其中一个关键“盾牌”便是降低其表面的靶点——CD20蛋白的表达。这导致依赖CD20结合起效的利妥昔单抗及其升级版疗法（如放射免疫治疗，Radioimmunotherapy, RIT）的“制导”失灵，疗效大打折扣。面对这一临床困境，科学家们思考：能否先修复或增强癌细胞的“靶标”，再给予精准打击？一项发表于《Cancer Treatment and Research Communications》的研究为此提供了初步的实验室证据。
该研究将目光投向了一种名为西达本胺（Chidamide）的表观遗传药物，它是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone Deacetylase Inhibitor, HDACi）。此前有研究表明，西达本胺能够上调淋巴瘤细胞的CD20表达。研究团队设想，将西达本胺与一种新型的靶向CD20的放射免疫治疗药物联合使用，或许能克服耐药。他们设计并合成了一种新型放射免疫偶联物：[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab。其中，利妥昔单抗作为精准制导的“载体”，将具有治疗作用的放射性核素镥-177（Lutetium-177, 177Lu）运送到肿瘤细胞；DOTAGA（一种双功能螯合剂）则是牢固连接两者的“锁链”。这种设计旨在利用射线直接杀伤肿瘤细胞，而不完全依赖利妥昔单抗原有的免疫杀伤机制。
为了验证这一联合策略，研究人员首先在实验室中培养了利妥昔单抗耐药（Rituximab-Resistant, RR）的Raji细胞（一种源自伯基特淋巴瘤的B-NHL细胞系模型）。他们用西达本胺预处理这些耐药细胞，试图“唤醒”其CD20表达。随后，他们将处理后的细胞暴露于两种杀伤剂下：一种是传统的利妥昔单抗与血清的混合物（模拟体内免疫杀伤环境），另一种则是新合成的[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab。
本研究主要采用了以下关键技术方法：1. 细胞模型构建：通过持续暴露于利妥昔单抗，从野生型Raji细胞中诱导出CD20低表达的利妥昔单抗耐药（RR）细胞模型。2. 流式细胞术：用于定量检测细胞表面CD20的表达水平。3. 放射免疫偶联物合成与表征：使用DOTAGA-anhydride作为螯合剂，与利妥昔单抗偶联后，用177Lu进行放射性标记，合成[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab，并通过薄层色谱法（TLC）评估其放射化学纯度和稳定性。4. 细胞毒性/活力测定：采用MTT法和Alamar Blue法评估不同处理（如西达本胺、利妥昔单抗-血清混合物、放射免疫偶联物）对细胞活力的影响。
研究结果揭示了以下几个方面：
1. 西达本胺对Raji细胞的作用
研究确认，经利妥昔单抗长期处理的Raji细胞，其CD20表达水平显著低于对照组，成功模拟了临床耐药状态。西达本胺处理24小时后，虽然能轻微上调RR细胞中的CD20表达，但这一变化在统计学上并不显著。然而，一个关键发现是：当这些经过西达本胺预处理的RR细胞再接触利妥昔单抗-血清混合物时，其细胞死亡率显著高于未用西达本胺预处理的对照组。这说明，西达本胺可能通过某种功能性调节，增强了CD20介导的免疫杀伤效应，而不仅仅是依赖CD20表达量的单纯提升。单独使用西达本胺或利妥昔单抗均未引起显著的细胞直接死亡。
M of chidamide treatment (B). Following chidamide treatment, the RR cells were treated with rituximab alone and rituximab-serum mixture (dilution of 1:4) (C). Intriguingly, there was a marked difference in cell death levels between chidamide-treated and untreated groups after the rituximab-serum mixture was given (P?=?0.0005; 95% CI: 17.04 – 36.1; n?=?3; unpaired T-test). The zero height of control group indicated no detectable cell death (D).">
2. [1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab的合成
研究团队成功合成了新型放射免疫偶联物[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab。他们优化了合成条件，发现利妥昔单抗与DOTAGA-anhydride的最佳摩尔比为1:10。该偶联物展现出优异的放射化学纯度（>98%）和突出的稳定性：在室温磷酸盐缓冲盐水（PBS）中144小时后纯度仍>99%，在37°C人血清中144小时后纯度仍>96%。与其他研究中使用不同螯合剂合成的177Lu标记利妥昔单抗相比，本研究使用的DOTAGA-anhydride因其高亲水性和反应性，可能贡献了更持久的稳定性。
177Lu-free was shown as a control (A). Rituximab-DOTAGA can be labeled by 177Lu in a molar ratio of 1:5 (B) and 1:10 (C), whereas a molar ratio of 1:25 (D) of rituximab-DOTAGA did not show any 177Lu labeled to the immunoconjugate.">
177Lu]LuCl3(A), radiochemical yield (B), and radiochemical purity (C) of [177Lu]Lu-DOTAGA-rituximab using Bioscan AR-2000 radio TLC instrument. The stability of [177Lu]Lu-DOTAGA-rituximab in PBS at room temperature (D) and in human serum at 37°C for 144 h (E). [177Lu]Lu-DOTAGA-rituximab was tested on the RS cells, and it significantly decreased cell viability compared to the control group (p < 0.0001; 95% CI: 31.77 – 30.29; unpaired T-test) (F). The cell viability decreased significantly in the RR Raji group receiving 5 μMof chidamide (p < 0.0001; 95% CI: 15.92 – 15.08) (G).">
3. [1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab对Raji细胞的作用
在CD20高表达的利妥昔单抗敏感（Rituximab-Sensitive, RS）Raji细胞上，[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab表现出显著的细胞毒性，显著降低了细胞活力，而未标记的利妥昔单资本身则无此效果，证实了细胞死亡源于放射性核素的杀伤作用。最重要的发现出现在耐药细胞上：在RR Raji细胞中，预先使用西达本胺处理，再给予[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab，可导致细胞活力显著下降，其效果明显优于未使用西达本胺的对照组。由于西达本胺单独使用并无明显毒性，该增强效应归因于放射免疫治疗活性的提升。研究指出，这种协同效应可能不完全依赖于CD20表达量的上调（因为上调并不显著），而可能与西达本胺作为HDACi所介导的放射增敏作用有关，例如通过增加染色质可及性、促进DNA损伤和诱导凋亡等途径，使肿瘤细胞对靶向放射治疗更加敏感。
结论与讨论显示，这项研究成功合成了具有高纯度和优良稳定性的新型放射免疫治疗药物[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab。更重要的是，它首次在体外概念验证层面上表明，表观遗传药物西达本胺能够增强利妥昔单抗耐药Raji细胞对利妥昔单抗-血清混合物以及新型靶向放射免疫治疗的敏感性。尽管CD20表达上调幅度有限，但西达本胺可能通过功能调节或放射增敏等机制，与靶向放射治疗产生了协同效应。这为克服临床B-NHL患者因反复使用利妥昔单抗导致的CD20下调及继发性耐药问题，提供了一种极具潜力的联合治疗新思路：即先使用西达本胺等药物“重塑”或“敏化”肿瘤微环境或肿瘤细胞本身，再应用靶向放射免疫治疗进行精准清除。
当然，研究作者也指出了本工作的局限性：仅使用了一种细胞系（Raji细胞），且耐药模型主要基于功能学（细胞活力）验证，缺乏对CD20表达下调具体分子机制的深入探讨。此外，研究未评估[1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab与CD20的结合免疫反应性，也未进行剂量反应关系和剂量学评价。这些都为未来的研究指明了方向。尽管如此，这项初步研究证实了“西达本胺 + [1??Lu]Lu-DOTAGA-rituximab”这一组合策略的生物学合理性和可行性，为其后续的体内实验、机制探索以及在更广泛淋巴瘤模型中的验证奠定了坚实的基础，有望推动针对利妥昔单抗耐药B-NHL的新型疗法向前发展。
