《Chem & Bio Engineering》：3D Aerohydrogel Scaffolds for Brain Tissue Engineering and In Vitro Neuroscience
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本文综述了三维气凝胶支架在脑组织工程与体外神经科学研究中的应用前景。该研究通过创新的引发式化学气相沉积（iCVD）技术，构建了具有超低密度、中空纤维结构的仿生支架，成功模拟了大脑微环境的生理架构。研究表明，该支架不仅能支持小胶质细胞和星形胶质细胞的长期三维共培养，还实现了细胞间可溶性因子的高效扩散与通讯。尤为重要的是，在脂多糖（LPS）刺激下，共培养体系中的星形胶质细胞展现出对小胶质细胞的保护性调节作用，有效降低了促炎因子IL6和IL1β的表达。这一平台为构建更精准、可靠的人源化脑疾病模型和减少动物实验提供了重要工具。
引言
中枢神经系统（CNS）是一个由高度特化的多种细胞类型构成的三维（3D）复杂组织。传统的二维（2D）细胞培养系统难以复现大脑功能所依赖的空间组织和动态细胞间相互作用。与此同时，由于物种差异，当前的动物模型在预测人类反应方面也面临挑战，且成本、伦理和实际应用限制进一步制约了其使用。因此，迫切需要能够更准确模拟原生大脑微环境的先进体外模型。体外测试系统具有实验条件高度可控、伦理问题较少及资源消耗较低等优势，尽管难以完全模拟生物体内的所有条件，但对基础研究和临床前研究仍至关重要。近年来，3D细胞培养系统成为研究焦点，因为与在常规塑料培养板上生长的细胞相比，在3D环境中生长的细胞表现出不同的特征。为尽可能模拟生理条件，多种3D细胞培养系统已被开发出来。
传统的支架材料通常通过冷冻干燥或微球包埋等工艺制备，这些方法会产生多孔的非自然粘附位点，且孔径和互连性受限，从而限制了细胞运动和化学物质的传输。通过静电纺丝制备的支架虽更接近细胞外基质（ECM）的纤维形态，但通常缺乏细胞浸润能力。这些材料虽然具有较大的开放体积，但其多孔结构不利于与周围环境进行物质交换所需的传质过程。生物应用中的支架材料需要具备适当的代谢物和营养物质扩散能力。
气凝胶支架的制备与特性
为克服这些限制，气凝胶作为一种新型的3D细胞支架被开发出来。气凝胶是纤维状的3D网络，形态类似于细胞外基质，具有超低密度，并且可根据制备过程中使用的前体在化学和机械性能上进行调控。气凝胶的制备首先通过烧结形成圆柱形的四足状氧化锌（t-ZnO）牺牲性模板（图1a）。随后，利用引发式化学气相沉积（iCVD）技术，在该模板上涂覆水凝胶薄膜（图1b）。iCVD是一种无溶液的工艺，能在复杂基底上形成保形的聚合物薄膜，并完全保留前体化学性质，甚至可以沉积具有定制性能的水凝胶薄膜。具体过程涉及乙烯基功能化前体和过氧化物引发剂的气流，通过针阀控制进入真空反应器。在反应器内，电阻丝在相对较低的200–400 °C温度下加热，使过氧化物引发剂裂解为自由基，同时保持单体完整。这些低粘附系数的自由基在放置有t-ZnO支架的冷却样品台上开始受控自由基聚合，促进单体附着，从而形成水凝胶包覆的互连微棒结构。随后的湿化学蚀刻去除氧化锌，最终形成互连的中空水凝胶微管网状结构（图1c）。
在众多可用的iCVD聚合物中，聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯（pHEMA）被报道具有作为支架材料所需的机械性能和防止非特异性蛋白结合的能力，同时生物相容性高。本研究首次成功地将基于iCVD的气凝胶应用于不同类型的胶质脑细胞（代表比先前应用的C2C12肌肉细胞更柔软的组织类别）作为细胞支架，并进一步研究了气凝胶在小胶质细胞和星形胶质细胞无物理接触的共培养系统中的应用。
材料表征与生物相容性验证
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）对材料进行化学表征，证实了iCVD聚合的成功以及前体官能团的保留。水凝胶在水性介质中具有特征性的溶胀行为，测量显示气凝胶在水中浸泡60分钟后吸水达到平台期。
为确保生物相容性并排除iCVD聚合物的任何毒性，使用原代肌腱来源的成纤维细胞进行了细胞毒性试验（WST-1法）。初始浓度和稀释后的条件培养基均未对细胞表现出任何毒性效应，稳定的细胞活力表明气凝胶与哺乳动物细胞共培养时无细胞毒性风险。随后，将气凝胶置于96孔板transwell小室中，以确保培养基的最佳供应，并用于脑细胞的单培养和共培养实验。
作为神经组织模型的应用
为研究气凝胶作为神经组织模型的适用性，使用了人永生化小胶质细胞和星形胶质细胞。这两种细胞类型对于维持大脑健康和协调神经炎症至关重要。星形胶质细胞是大脑中最丰富的细胞类型，负责大脑稳态和细胞外基质发育。小胶质细胞则是中枢神经系统的常驻免疫细胞。
人稳定细胞系小胶质细胞被接种在气凝胶支架上并成功培养了多天。培养3天后，钙黄绿素AM活细胞染色显示支架表面有大量活细胞，并且在这短时间内，细胞已开始向支架内部迁移。基于刃天青的细胞活力测定也证实了细胞活力，该测定显示，与仅含培养基的空白对照组相比，接种在支架上的细胞能将添加到孔板培养基中的染料还原为荧光成分，这表明孔板中的培养基与支架内细胞之间存在着深刻的物质交换。通常，由于支架材料本身的结构，其中的扩散较为困难，内部的细胞可能面临营养和氧气供应减少的问题。而气凝胶支架凭借其高孔隙率，实现了贯穿支架的持续扩散，确保了孔板培养基与支架之间充分的物质交换。扫描电子显微镜（SEM）图像进一步表明，小胶质细胞很好地适应了支架的多孔表面。这些结果表明，人小胶质细胞在较短时间内对支架材料耐受良好。
共培养系统中的细胞互作与保护效应
在用脂多糖（LPS，1 μg/mL，24小时）处理后，接种在常规塑料孔板中的细胞以及单培养在支架上的小胶质细胞，其细胞活力与未处理的对照组相比均显著下降。然而，与星形胶质细胞在支架上共培养的小胶质细胞，其细胞活力并未出现显著下降。有趣的是，细胞活力的下降在单培养于支架上的小胶质细胞中最为显著，降低了近50%。这可能是因为小胶质细胞在二维塑料表面培养时被内在激活，而在更接近生理相关的三维环境中培养时，这种内在激活可能减弱。
除了细胞活力的变化，还通过定量聚合酶链反应（qPCR）分析了小胶质细胞在mRNA水平上的反应。作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，小胶质细胞能产生大量促炎细胞因子，从而促进有害的神经炎症。白细胞介素-6（IL6）和白细胞介素-1β（IL1β）是两个最丰富的促炎细胞因子。LPS的添加增加了接种在常规塑料孔板中的细胞以及单培养在支架上的小胶质细胞的IL6 mRNA水平。然而，与星形胶质细胞在支架上共培养的小胶质细胞，其IL6 mRNA水平与未处理的对照组相比却有所降低。IL1β的变化趋势类似，但整体mRNA水平的反应较低。这些结果表明，支架上培养的小胶质细胞能对LPS处理产生反应。更重要的是，这揭示了共培养中星形胶质细胞的调节作用，从而证明了共培养细胞之间无需直接接触即可实现有效的通讯。气凝胶结构允许生物物理信号从一个支架扩散到另一个支架，这是共培养中细胞通讯所必需的。
结论与展望
通过紧密模拟原生大脑微环境，气凝胶填补了神经组织建模中的一个关键需求。气凝胶已成功用作不同脑细胞类型的细胞支架，并可快速适应其他组织的要求。FTIR化学分析验证了iCVD自由基聚合的成功以及化学官能团的保留。WST-1试验表明无细胞毒性，小胶质细胞和星形胶质细胞在单培养和共培养中的细胞活力测定也成功进行，显示了生物相容性和降低的细胞内在反应性。有趣的是，观察到了星形胶质细胞对小胶质细胞在响应LPS时的保护行为，这突显了尽管细胞在物理上是分离的，但细胞间的串扰并未受损。虽然气凝胶在各种溶剂中通常化学性质稳定，但未来在脑组织工程中的应用可以利用其通过酯基进行生物降解的可能性，这有待测试。由于降解副产物是不希望的，而支架的低密度和降解过程中产生的副产物数量少，使其成为未来神经组织工程的优秀材料选择。这项工作为应用气凝胶替代手术干预或创伤后的脑组织奠定了基础。
材料与方法概览
气凝胶的制备以四足状氧化锌为牺牲模板，经iCVD涂覆聚（HEMA-共-EGDMA）水凝胶薄膜，再经湿化学蚀刻得到中空微管网状结构。表征方法包括FTIR、溶胀测试、细胞毒性试验（WST-1法）。细胞实验使用人永生化小胶质细胞系HMC3和人胎儿星形胶质细胞系SVGA，在气凝胶支架上进行单培养及共培养。细胞活力通过钙黄绿素AM染色和AlamarBlue（刃天青）法评估。基因表达分析使用qPCR检测IL6和IL1β的mRNA水平。细胞形貌通过扫描电子显微镜观察。所有数据均以平均值±标准差表示，并使用GraphPad Prism进行统计学分析，p< 0.05被认为具有统计学显著性。
