《JACS Au》：Cryptic Binding Pockets in PDC-3 β-Lactamase Modulate Resistance Profiles
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本文通过整合增强采样技术与无监督深度学习，首次全面绘制了C类β-内酰胺酶PDC-3中Ω-loop的完整构象图谱，揭示了E219和Y221作为关键“分子开关”，通过调控酶在结晶样、扩张和收缩三种状态间的转换来重塑活性位点并决定耐药谱。研究发现，扩张状态下D217可扮演类似A类酶E166的“备用”催化碱基角色，而收缩状态下活性位点被遮蔽时，会暴露出一个全新的、可作为别构抑制靶点的隐秘口袋。本研究不仅为理解抗生素耐药性的动态机制提供了新视角，其提出的“增强采样+深度聚类”集成方法学框架也具有广泛的普适性，为针对其他高动态性蛋白的构象探索和药物设计开辟了新途径。
引言
蛋白质以动态构象集合体形式存在，其固有的运动可能产生瞬态的、隐藏的或隐秘的状态。这些未被静态晶体结构捕获的状态，如埋藏的口袋或替代的环结构，可能具有重要的功能和药理学意义。越来越多的证据表明，酶利用构象灵活性来调节活性、实现别构调节，甚至暴露抑制剂的结合位点。然而，由于这些状态出现频率低，传统的实验和经典分子动力学（MD）模拟通常难以捕捉到它们。
C类β-内酰胺酶PDC-3（铜绿假单胞菌来源的头孢菌素酶）为此项挑战提供了一个绝佳的研究案例。PDC-3是一种能水解多种β-内酰胺抗生素的丝氨酸β-内酰胺酶。其中，Ω-loop是一个高度灵活的突变热点区域，其中的残基（如V211、G214、E219、Y221）频繁发生替换，这些突变被发现能通过改变酶动力学和底物特异性来显著增强抗生素耐药性。
本研究以PDC-3的Ω-loop为模型系统，开发了一种集成的计算与实验策略来捕获和分析隐藏构象状态。传统模拟方法可能仅能窥见这些状态的惊鸿一瞥。因此，我们采用了调和元动力学（WT-MetaD）这一增强采样技术来驱动Ω-loop的构象转换。捕获状态仅是解决了部分问题，从庞大的模拟数据集中提取信息是另一项挑战。为此，我们利用了无监督深度学习，即一个在蛋白质构象上训练的卷积变分自编码器（CVAE）。变分自编码器能够学习复杂结构集合的低维表示。我们将CVAE用于编码蛋白质距离矩阵数据到反映Ω-loop主要构象自由度的潜在特征空间。通过进一步对CVAE潜在空间应用降维（UMAP）和聚类（HDBSCAN），我们可以检测出对应于不同构象状态的离散簇。
结果与讨论
增强采样揭示残基219和221诱导的显著构象变化
为探究V211、G214、E219和Y221位置的突变如何影响PDC-3的动态行为，我们使用其主链二面角作为关键集体变量（CV）进行了WT-MetaD模拟。从这些模拟中，我们选取自由能低于-200 kJ/mol的稳定构象帧进行详细结构分析。
当在野生型PDC-3中偏置V211或G214的主链扭转角时，酶的构象仍与晶体形式相似，均方根偏差（RMSD）值很少超过2.0 ?。相反，E219和Y221充当了强有力的“开关”。偏置野生型PDC-3的E219或Y221经常使RMSD超过2.5 ?，并显著放大了活性位点口袋周围的均方根涨落（RMSF），表明活性位点景观发生了实质性重组1分布与野生型相比Jensen-Shannon散度 > 0.5的40个残基在PDC-3结构上的映射。">。这些发现表明，PDC-3残基211和214的主链扭转变化不会显著改变活性位点的构象，而残基219和221则具有重组环区域、重塑活性位点结构的能力。
对突变系统的研究强化了这些结构见解。具体而言，V211A替换在很大程度上保持了酶的天然结构，而V211G诱导了Ω-和R2-环内的局部流动性轻微增加。类似地，G214A诱导了活性位点附近Ω-loop的中等结构波动。G214R替换主要影响Ω-loop和R2-loop的外围区域。相比之下，E219和Y221的替换引发了主要的构象变化，并对抗生素耐药性产生了最显著的影响。在模拟中偏置这些主链位置会驱动大的RMSD偏移(>2.5 ?)并极大地增加了环的柔性，标志着活性位点的重组。实验上已知，219或221位的替换会扩大AmpC β-内酰胺酶的底物谱。这些结构扰动与耐药性的急剧增加密切相关，特别是针对具有大侧链的头孢菌素类（如头孢他啶和头孢洛扎），其最低抑菌浓度（MIC）的增强幅度（从8倍到128倍）远超V211或G214突变所引起的。例如，E219K将头孢他啶的MIC从约2提升至64 μg/mL（32倍），头孢洛扎的MIC从约0.5提升至64 μg/mL（128倍）；而Y221A将头孢洛扎的MIC提高了64倍，头孢他啶的MIC提高了16倍。这些极高的RMSF值，连同耐药性的急剧增加，表明E219K和Y221A可能解锁了一种野生型AmpC所不具备的、水解药物的隐藏能力。
为了解这些主链扭转变化如何在PDC-3中传播，我们计算了所有模拟系统中每个残基的侧链χ1扭转角。野生型V211系统（其构象与晶体结构非常接近）被用作参考。有四十个残基的Jensen-Shannon（JS）散度值超过0.5，标志着这些位点的侧链构象发生了显著改变。在这些残基中，仅有六个残基（S66、F121、D217、T289、T319和R349）位于活性位点口袋内部或附近。V211突变体和野生型G214系统通常未超过0.5的JS阈值；然而，214位残基的突变（G214A和G214R）显著改变了S66的χ1角，表明结构扰动直接传递到了催化基序S64–K67。同样，在E219A、E219K、Y221A和Y221H突变体中一致观察到S66的显著改变，表明219和221位残基的突变能可靠地将结构变化传播至催化位点。此外，E219和Y221位点的替换也显著影响了来自另一个保守催化基序的残基T319，突显了它们广泛的结构和功能影响。残基F121仅在E219K突变体中显示出高于0.5的JS散度，表明E219K对P2-loop构象有特别强的影响。位于R2-loop内的残基T289基本不受V211、G214、E219或Y221野生型运动的影响，但在G214R以及多个E219和Y221突变体中显示出0.8的高JS散度。同样，这些变异也影响了活性位点附近R349，该残基对于底物结合至关重要。这些发现表明，E219、Y221突变体以及G214R可以显著影响负责容纳头孢菌素抗生素R2侧链的R2结合位点。位于活性位点附近Ω-loop区域的残基D217独特地显示出在211和214位残基改变时构象变化可忽略不计，但在涉及219和221位残基的野生型和突变条件下都表现出显著变化。这一观察结果与RMSD/RMSF分析一致，强化了残基219和221作为关键开关、能够在整个酶结构网络中传播扭转重排作用的观点。
为验证这些基于模拟的预测，我们研究了这些Ω-loop替换如何影响酶功能。我们进行了以硝基头孢菌素（NCF）作为报告底物的稳态抑制实验，并添加头孢他啶和头孢洛扎作为竞争配体。NCF动力学在所有变异体中均保持稳健（即与野生型PDC-3相差约在2倍以内），表明这些突变并未破坏保守的催化核心，也未严重损害针对相对紧凑的底物硝基头孢菌素的通用β-内酰胺酶活性。相比之下，头孢他啶和头孢洛扎是体积大得多的头孢菌素，其延长的侧链更严格地探测Ω-loop和R2-loop的形状和动力学。相应地，头孢他啶和头孢洛扎的表现抑制常数清楚地区分了携带V211/G214突变的变异体与那些在E219/Y221发生替换的变异体。V211和G214的替换仅导致头孢他啶（0.5-2倍）和头孢洛扎（3-4倍）的表现抑制常数发生适度变化。相比之下，我们模拟鉴定为分子开关的E219和Y221位点的替换则导致Ki值大幅增加（头孢他啶增加4至50倍，头孢洛扎增加5至7倍）。这些变化的模式和幅度与先前的MIC数据密切吻合，支持了以下结论：219和221位点的突变通过重塑Ω-loop和R2-loop的几何形状来强烈影响体积大头孢菌素的结合口袋，而211和214位点的突变则影响弱得多。
无监督聚类区分不同的多重构象
为了系统地研究模拟中访问的构象状态，我们将无监督深度学习和聚类应用于低能结构集合。在训练CVAE对结构进行距离矩阵表示后，我们使用它将每一帧嵌入到潜在空间。通过UMAP可视化潜在嵌入，并随后进行HDBSCAN聚类，揭示了十个不同的簇。这些簇捕捉了PDC-3及其变异体中一系列Ω-loop构象：一个与实验确定的晶体结构高度相似的经典结晶样集合（簇1）、一个Ω-loop向外摆动、活性位点裂隙扩宽的扩张集合（簇2-6），以及一个Ω-loop向内移动导致活性位点变窄或闭塞的收缩集合（簇7-10）。
所有系统均能在一定程度上采样到簇1状态，反映了天然构象的内在稳定性。当偏置野生型PDC-3的残基211或214、或V211变异体的残基211的主链扭转角时，几乎所有构象都落入结晶样的簇1中。这种行为与动力学数据一致，数据显示V211替换仅引起相对于野生型PDC-3的适度变化。相反，当在G214变异体中偏置残基214时，相当一部分构象群体占据了结晶样区域之外的扩张簇，特别是对于G214A。这种向扩张状态的群体再分布为其Km值比野生型PDC-3降低约3倍（36.3 ± 12.0 → 12.8 ± 8.9 μM）提供了结构基础。偏置残基219或221则产生了更为多样化的构象分布，大多数帧落在了结晶样簇1之外，进入了扩张或收缩簇。因此，群体分布分析支持我们将残基219和221解释为分子开关。这些位点的突变使群体从结晶样区域重新分配到能强烈重塑大体积头孢菌素结合口袋的替代构象，这与其显著的动力学和耐药谱相符。
对每个簇的详细检查阐明了这些状态背后的具体结构特征。在结晶样的簇1中，Ω-loop紧密贴合活性位点口袋，其稳定靠的是广泛的相互作用网络。D217对这一网络至关重要，其主链原子与G214、G220、Y221或G222的邻近主链原子形成氢键。D217的侧链还与P2-loop上的K126形成强盐桥，显著增强了Ω-loop的结构刚性并限制了其过度灵活性。D217的重要性在其极高的保守性中得到强调。此外，疏水相互作用进一步稳定了Ω-loop。所有这些相互作用共同将Ω-loop牢固地固定在催化口袋附近，保持了催化残基K67和G220之间关键的氢键。K67-G220和Y150-A292氢键控制着活性位点的扩张和收缩。破坏这些特定键是簇2-10中替代状态的一个标志。
簇2-6构成了以活性位点戏剧性扩张为特征的构象集合。在这些状态中，Ω-loop向外移动（有时G220的Cα原子位移超过10 ?），扩大了活性位点裂隙。在几乎所有扩张态构象中，K67-G220氢键都消失了。类似地，Y150-A292相互作用也被削弱或破坏。在这个广泛的扩张构象类别中，我们的聚类区分了几种具有细微差异的子状态。例如，簇2主要由来自G214A和Y221H模拟的帧构成，其特点是Ω-loop发生显著扭转，使G220远离K67。值得注意的是，在簇3-6中一致观察到一个显著的结构特征：即最初在簇2中发现的强化的K67-D217盐桥。将代表性构象与A类β-内酰胺酶KPC-2的晶体结构进行比对发现，PDC-3中的D217占据了一个与KPC-2中E166类似的位置。已知E166在A类β-内酰胺酶的催化机制中扮演着关键碱基的角色。那么，D217是否能在某些条件下承担类似的催化功能呢？早期的研究认为C类β-内酰胺酶缺乏一个等同于A类酶E166的酸性残基。然而，D217对稳定Ω-loop和活性位点结构有重要贡献。此位点的突变可能增强Ω-loop的灵活性，扩大口袋以容纳具有大侧链的头孢菌素，从而增强耐药性。相反，这种结构变化似乎对青霉素或碳青霉烯类底物不利，这暗示D217可能在特定条件下扮演类似E166的辅助催化角色。
为了进一步探究这种可能性，我们从一个代表性的扩张Ω-loop构象中的PDC-3与青霉烷酸的非共价Michaelis复合物开始进行了量子力学/分子力学（QM/MM）模拟。在此状态下，K67和D217的侧链非常接近。尽管从K67直接向D217质子转移在结构上似乎是可行的，但QM/MM自由能扫描显示，随着质子从K67移动到D217，能量上升约5 kcal/mol，并未显示出D217质子化物种的稳定最小值。受先前关于A类β-内酰胺酶TEM-1的QM/MM研究启发，其中K73→E166质子转移通过催化丝氨酸和一个桥接水分子进行，我们接下来在PDC-3中检查了类似的水介导接力。结果显示存在一个低能垒（约5–6 kcal/mol）的接力过程K67 → S64 → H2O → D217，产物态（质子位于D217上）对应一个浅的自由能极小值。因此，在扩张的Ω-loop构象中，D217可以通过K67→S64→H2O→D217接力被瞬时质子化，并承担类似E166的催化碱基角色。
在簇7-10中，残基219和221（E219A、E219K和Y221A）变异体的特定主链扭转变化可导致催化口袋的塌陷，其中两个环相互靠近并使活性位点裂隙收缩。例如，E219K替换（簇7）促使Ω-loop剧烈地向螺旋11移动。这种位移破坏了涉及P215和L216的天然接触；取而代之的是，P215与P2-loop的L119和螺旋10上的L293形成疏水接触，而D217则与残基S64、S318和T319建立氢键。收缩构象严重限制了对催化丝氨酸的可及性，实质上将底物排除在活性位点之外。引人注目的是，催化位点的闭塞同时揭示了在Ω-loop另一侧的一个先前未被观测到的隐秘口袋。显示出此口袋的E219K变异体构象占集合的一半以上，表明该隐秘口袋对应一个反复出现的亚稳态，而非罕见的孤立波动。这个隐秘位点构成了一个有吸引力的别构抑制靶点。设计特异性靶向此外部口袋的抑制剂可以将酶稳定在催化失活的构象，从而阻止β-内酰胺抗生素的有效结合和水解。
结论
本研究提出了一个结合了调和元动力学与无监督深度聚类流程（CVAE→UMAP→HDBSCAN）的集成工作流程，成功捕获了PDC-3中Ω-loop的完整构象景观。相比传统的长时间尺度无偏模拟，此策略以可承受的计算成本高效跨越了高自由能垒，并自动将大量轨迹数据分类为清晰可辨的子集合，为后续的结构分析奠定了坚实基础。
动态分析揭示，无论野生型还是突变体，残基219和221的主链扭转角是驱动活性位点大规模扩张和收缩的关键开关。通过重连周围的氢键和疏水网络，这些残基精细地控制着底物的可及性，直接影响酶活性。相比之下，残基211和214主要影响局部柔性而不重塑整体拓扑结构。值得注意的是，残基D217在众多扩张构象中持续与K67形成稳定的盐桥，其空间位置与A类β-内酰胺酶中的催化碱基残基E166高度类似。这种结构类比提出了一个有趣的可能性：D217可能在特定构象和底物下短暂地充当替代催化碱基。这种辅助催化功能不仅能解释观察到的C类β-内酰胺酶催化效率和底物特异性的变化，也为抗生素选择和个性化治疗策略提供了有价值的指导。此外，在Ω-loop向内位移导致活性位点闭塞的构象簇中，我们识别出了一个位于Ω-loop外侧的先前未被发现的空腔。尽管该空腔与催化丝氨酸在空间上相距较远，但它可能成为一个非竞争性抑制剂的新靶点，能够将酶锁定在无活性构象并阻断抗生素水解。然而，在计算机中识别隐秘口袋与将其确立为实用药物靶点之间存在巨大差距。本研究为未来的工作提供了结构和机制基础。
此外，隐秘结合位点为解决抗生素耐药性提供了宝贵的机会。这种隐秘口袋提供了新的干预点，是仅关注静态活性位点的传统基于结构的设计会错过的。这一策略拓宽了抑制剂设计的化学空间，并实现了构象选择性抑制，这可能有助于对抗耐药变异体保持效力。
总体而言，这项研究不仅为理解PDC-3中抗生素耐药性的动态机制提供了新见解，也展示了“增强采样 + 深度聚类”集成方法的广泛适用性和潜力。同时，它为探索其他高度动态蛋白（如激酶激活环和GPCR胞外区）的隐秘构象状态提供了有价值的、可迁移的方法学启示。
方法与材料
调和元动力学模拟
PDC-3 β-内酰胺酶的结构起始于蛋白质数据库（PDB ID: 8SDR）。九个在高度耐药铜绿假单胞菌临床分离株中检测到的变异体（V211A, V211G, G214A, G214R, E219A, E219G, E219K, Y221A, Y221H）通过计算机建模构建。所有系统均根据高通量分子动力学（HTMD）方案进行参数化。蛋白质用Amber ff14SB力场描述，水使用显式TIP3P模型。每个系统先用最陡下降积分器进行3000步能量最小化，然后在NPT系综中平衡5 ns。使用ACEMD程序结合PLUMED 1.3插件运行WT-MetaD模拟。为探究突变如何影响蛋白质动力学，我们选择选定残基的主链?和ψ二面角作为集体变量（CVs）。对于野生型PDC-3，进行了四次独立的WT-MetaD模拟，每次使用一个残基（V211, G214, E219或Y221）的?和ψ角作为CVs；对于每个变异体，则以对应突变残基的主链二面角作为CVs。在3 μs的WT-MetaD模拟后，自由能面收敛。每个系统的自由能谱被重构，并将其最大值设为0 kJ/mol。所有自由能低于-200 kJ/mol的结构被提取用于后续分析。
卷积变分自编码器模型构建
从每条WT-MetaD轨迹中，我们仅提取自由能低于-200 kJ/mol的帧，以确保分析聚焦于稳定、功能相关的构象。从每个低能快照中，我们通过测量以下残基之间的成对Cα距离构建了一个53 × 53的距离矩阵：(1) 三个保守催化基序：S64–K67, Y150–N152, 和 K315–G317；(2) Ω-loop片段 L209–S226；(3) 螺旋10残基 L280–Q294；以及(4) 排列在活性位点或其附近的其他残基。53 × 53的矩阵被填充一行一列零值，形成54 × 54的数组。在训练前，所有距离通过除以整个数据集中的最大距离重新缩放到[0, 1]区间。每个距离矩阵因此提供了一个蛋白质构象的二维“图像”，其中局部接触模式反映了Ω-loop定位和更广泛的三级结构重排。
为了学习这些构象的紧凑表示，我们使用TensorFlow 2.4.0在所有变异体生成的距离矩阵集合上训练了一个CVAE。CVAE的编码器由三个卷积层组成，解码器是此架构的镜像。模型配置为单个输入通道，批次大小为512，潜空间为8维。模型训练了100个周期，使用RMSprop优化器。损失函数定义为重建误差与Kullback–Leibler散度的加权和。一旦训练完成，CVAE编码器将每个距离矩阵映射到一个捕获Ω-loop及周围结构基序主要构象变化的8维潜向量。为了可视化和聚类这些嵌入，我们应用UMAP将8维潜向量降至二维。最后，我们在二维UMAP嵌入上使用HDBSCAN来识别Ω-loop的不同构象状态。
结构分析
所有RMSD和RMSF计算均在自由能低于-200 kJ/mol的帧上进行。使用MDTraj，每个选定的帧通过应用于所有Cα原子的最小二乘拟合程序对齐到平衡后的参考结构。RMSD随后计算为对齐后Cα位置与其参考坐标的均方根偏差。对于RMSF分析，我们测量了每个残基Cα位置相对于其参考坐标在所有对齐低能帧上的均方根涨落。此外，除了丙氨酸和甘氨酸，我们从每一帧提取了所有残基的侧链χ1扭转角。为了量化突变如何改变侧链扭转角的分布，我们计算了每个变异体与野生型PDC-3之间χ1角分布的Jensen-Shannon（JS）散度。氢键、盐桥和疏水接触使用MDAnalysis和自定义脚本进行识别和量化。
QM/MM设置和伞形采样
从增强采样模拟中选择了K67和D217形成盐桥的PDC-3代表性构象，然后将青霉烷酸放入活性位点以构建PDC-3与β-内酰胺底物的非共价Michaelis复合物，为后续QM/MM计算提供笛卡尔坐标。蛋白质用AMBER ff14SB力场描述，水用TIP3P模型，青霉烷酸用GAFF2参数化。复合物溶解在近似10 ?缓冲的矩形TIP3P水盒中，并用Na+/Cl-抗衡离子中和。溶剂化系统先进行最小化，然后在500 ps内从0 K加热到300 K，并在300 K下平衡2 ns。所有MD模拟均使用AMBER 22进行。最终平衡的快照为QM/MM模拟提供了初始坐标。
QM/MM模拟使用Amber22在300 K的恒体积系综中进行，时间步长为1 fs。青霉烷酸盐底物20 ?范围内的所有水分子被保留用于QM/MM计算并包含在MM区域（催化水分子除外，它被包含在QM区域）。QM区域包括整个青霉烷酸分子、S64、K67和D217的侧链，以及介导质子转移的桥接水。QM子系统采用PM6半经验水平处理，并使用静电嵌入方案耦合QM和MM区域。考虑了两个一维反应坐标。对于K67到D217的直接路径，坐标定义为转移质子与K67的Nζ
