模块化乙烯基磷酰胺酯：一种用于半胱氨酸导向蛋白质靶向的新型选择性共价弹头

《Journal of the American Chemical Society》：Modular Vinyl Phosphonamidates for Cysteine-Directed Protein Targeting

这篇文章系统性地介绍了乙烯基磷酰胺酯（VPA）作为一种新颖的、模块化的半胱氨酸定向亲电体，并将其应用于开发选择性共价抑制剂和化学探针。研究证实，与传统的氯乙酰胺和丙烯酰胺亲电试剂相比，VPA展现出显著降低的内在反应性和非特异性标记，同时通过功能化阿法替尼（Afatinib）和依鲁替尼（Ibrutinib）等FDA批准的共价抑制剂，有效实现了对表皮生长因子受体（EGFR）和布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）的高选择性靶向抑制与标记。此外，研究还利用VPA的模块化特性，一步法合成了预功能化探针，并成功构建了首个基于VPA的蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC），实现了对BTK的选择性降解，展示了其在扩展共价药物化学空间、提升靶向选择性和开发新型蛋白降解疗法方面的巨大潜力。

　　

在共价抑制剂和靶向半胱氨酸的化学探针成为药物发现和蛋白质组学重要工具的背景下，本研究引入了一种新型的潜在半胱氨酸亲电体——乙烯基磷酰胺酯（VPAs），并系统评估了其反应性、选择性及在开发共价抑制剂方面的潜力。与成熟的氯乙酰胺和丙烯酰胺亲电试剂相比，VPA对模型硫醇谷胱甘肽（GSH）表现出显著降低的内在反应性，并且在人细胞裂解物中仅显示出非常有限的非特异性反应活性。

结果与讨论

VPAs的一般反应性

研究初期，将VPA试剂1的普遍亲电性与成熟的丙烯酰胺2和氯乙酰胺3亲电体进行了比较。使用还原型谷胱甘肽（GSH）作为模型硫醇在生理pH（7.4）下测试模型化合物1a–3a的反应性。结果显示，N-苯基取代的氯乙酰胺3a在反应3小时后几乎完全消耗（t_1/2= 0.8小时），而类似的丙烯酰胺2a表现出更温和的反应性（t_1/2= 2.6小时）。相比之下，N-苯基-O-乙基取代的VPA 1a在3小时内几乎没有任何消耗（t_1/2= 235小时），凸显了其极低的内在反应性。此外，1a与L-赖氨酸在5天的孵育期内也未检测到反应或降解产物，强调了乙烯基磷酰胺酯的半胱氨酸选择性和缓冲液稳定性。

在细胞裂解物中进行基于凝胶的活性蛋白质谱分析（ABPP）进一步验证了VPA的低反应性。炔烃功能化试剂（1b–3b）在RAMOS细胞裂解物中孵育后，氯乙酰胺探针3b产生最强的荧光信号，丙烯酰胺探针2b次之，而VPA探针1b仅产生非常微弱的信号（<1%）。采用CAPA（氯烷烃渗透性测定）评估了VPA化合物的细胞渗透性，结果表明VPA功能化小分子具有良好的细胞渗透性，甚至优于相应的丙烯酰胺版本。

随后，采用竞争性定量半胱氨酸蛋白质组学工作流程评估了VPA“侦察片段”（1c）的配体导向反应潜力。与之前的实验结果一致，磷酰胺酯修饰的侦察片段1c配体结合的半胱氨酸数量最少，而氯乙酰胺3c则表现出非常高的混杂性。由于磷酰胺酯亲电体的内在反应性低，研究者推断将其功能化到更复杂的配体上将有助于在生物系统中高效靶向半胱氨酸。

使用基于VPA的抑制剂抑制和细胞内核标记EGFR

为了验证这一想法，研究选择了首个获批的基于TCI的药物——第二代靶向EGFR的药物阿法替尼（Afatinib）作为支架。研究者提出用VPA（在4a中）替换原来的4-二甲氨基巴豆酰胺（DMAC）弹头，以探索VPA在工程化TCI中的应用。分子对接表明，4a的两种立体异构体都能够与EGFR的Cys797形成共价键，且PA功能化配体与靶蛋白的相互作用方式与原药相似。2倍数变化 >2.5且调整后p值 <0.01的蛋白质被视为显著富集。(i) 使用10 μM探针5和7下拉获得的显著富集蛋白质总数。(j) 使用10 μM探针5和7下拉获得的选定蛋白质富集效率热图比较。">

通过化学选择性Staudinger膦亚胺反应合成了药物类似物4a。体外激酶实验表明，4a以0.67 nM的IC₅₀抑制野生型EGFR，其抑制作用显著强于非反应性乙基磷酰胺酯类似物4b（IC₅₀= 2.5 nM），并与阿法替尼（0.31 nM）效果相当。动力学参数测定显示，4a的k_inact/K_I比率为97 × 10³M^-1s^-1，约为阿法替尼（164 × 10³M^-1s^-1）的一半。

接着，合成了炔烃功能化变体4c，并在基于凝胶的ABPP中进行了测试。在过表达野生型EGFR的A431细胞中，4c（1 μM）处理后在130-250 kDa处显示出强烈的荧光信号（指示EGFR），而DMSO对照组则没有明显信号。使用过量阿法替尼（5 μM）预处理后，强烈的荧光信号消失，表明了对EGFR的选择性共价结合。

为了与之前验证的阿法替尼衍生探针5和6进行公平比较，合成了相应的磷酰胺酯类似物7。该探针同样显示出对EGFR的选择性标记，且该标记可被过量的阿法替尼消除。浓度依赖性标记实验显示，7在低至5 nM的浓度下即可检测到信号。与基于迈克尔加成受体的探针相比，VPA探针7即使在探针浓度 >1 μM时也表现出卓越的靶点选择性。凝胶内荧光的光密度分析显示，在10 μM时，其选择性比含DMAC的探针5提高了近10倍，比探针6提高了3倍以上。时间过程标记实验表明，即使在长达6小时的孵育时间内，7的靶点选择性也未下降。

通过蛋白质组学下拉实验进一步分析了探针标记的蛋白质。无标记定量（LFQ）分析显示，对于探针7，EGFR是唯一相比DMSO对照显著富集的蛋白质，再次突出了PA亲电体的优异选择性。在更极端的条件下（10 μM探针浓度），虽然5和7都富集了相当数量的蛋白质，但EGFR仍然是磷酰胺酯探针最显著的靶点之一，而对于5则程度较轻。总体而言，两种探针获得的脱靶蛋白存在一定程度的互补性。

使用基于VPA的探针标记和抑制BTK

受到上述结果的鼓舞，研究者将研究范围扩展至另一类激酶抑制剂。依鲁替尼（Ibrutinib）是一种FDA批准的布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂。由于脂肪族VPA反应性较低且在酸性条件下易水解，研究者对结构进行了一些调整，基于吡唑并[3,4-d]嘧啶支架合成了一系列带有不同芳香族连接基的VPA探针（8–11）。

在RAMOS细胞中进行的基于凝胶的ABPP实验显示，已建立的BTK探针PF-06658607 (12) 在80 kDa（BTK）附近有一条明显的条带，同时在60 kDa附近有一个显著的脱靶条带。相比之下，所有四种PA探针仅在BTK相同高度处获得一条强烈的条带，其中探针9产生的标记强度最高，与丙烯酰胺探针12相当。

通过细胞内标记结合链霉亲和素下拉与LC-MS/MS分析验证了最佳探针9标记的蛋白质身份。在10 μM探针浓度下，VPA 9仅以高度选择性的方式富集了BTK和三个脱靶蛋白，而丙烯酰胺基探针12的脱靶数量则多得多（73个）。

最后，评估了基于乙烯基磷酰胺酯的依鲁替尼类似物9a的抑制效率。体外激酶抑制实验表明，VPA 9a能以较低的纳摩尔浓度IC₅₀（22 nM）显著抑制BTK激酶活性。虽然依鲁替尼的效力几乎是9a的五倍，但9a的抑制效率与配备双环丁烷羧酸酰胺或3-溴-4,5-二氢异噁唑亲电基团的依鲁替尼类似物（均为17 nM）相当。此外，9a明显比非反应性乙基磷酰胺酯9b（IC₅₀为208 nM）更有效。这些结果强烈表明VPA 9a通过共价相互作用有效抑制了BTK的激酶活性。

利用VPA的模块化特性进行一步法标记和PROTAC开发

对接研究表明VPA的O-取代基指向结合口袋外部，研究者试图利用这一结构特征。许多蛋白质特异性共价探针依赖炔烃标签作为下游应用的最小生物正交识别手柄。然而，预功能化探针可能更有优势。为了测试是否可以引入大体积取代基（如荧光团）而不干扰BTK的共价标记，研究者用荧光素叠氮化物（13）对探针9进行了合成后功能化。

由于荧光素已知是细胞不通透的，研究者在RAMOS细胞裂解物中孵育了递增浓度的13并通过凝胶ABPP进行分析。即使在低纳摩尔浓度下，也能在BTK分子量对应位置看到一个清晰的荧光条带。标记强度呈剂量依赖性增加，即使在1 μM的较高探针浓度下也表现出优异的靶点选择性。

鉴于VPA功能化配体支架能良好耐受更大体积的O-取代基，研究者着手开发一种双功能蛋白质降解剂。蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一类有前景的治疗剂，通过诱导靶蛋白与E3泛素连接酶接近，进而导致靶蛋白的多聚泛素化和随后的蛋白酶体介导的降解。为了构建一个基于VPA的共价PROTAC，研究者使用了常用的靶向CRBN的E3连接酶招募剂泊马度胺（pomalidomide），通过一个短的PEG间隔基将其连接到9上，得到化合物14。随后评估了14能否在RAMOS细胞中诱导BTK降解。Western blot分析显示，处理24小时后出现了BTK的浓度依赖性降解。定量结果显示DC_MAX约为77%，DC₅₀为0.44 μM。最后，研究者通过无标记定量蛋白质组学研究了14的全蛋白质组选择性。在所有定量的蛋白质中，只有BTK和已知的依鲁替尼脱靶蛋白BLK的消耗超过50%且p值 < 0.01。这些结果进一步突出了本文提出的VPA亲电体的优异选择性。

结论

总之，本研究引入了VPA作为一类有前景的半胱氨酸靶向亲电体，用于开发共价化学蛋白质组学探针和共价抑制剂。初步研究表明，与传统氯乙酰胺和丙烯酰胺亲电试剂相比，VPA表现出显著降低的内在亲电性，凸显了其提高全蛋白质组选择性的潜力。通过利用不饱和P(V)衍生物的直接可及性和模块化特性，研究者成功地将VPA亲电体整合到EGFR和BTK的靶向共价抑制剂中，这些抑制剂能有效抑制激酶活性，并在活细胞中选择性地结合各自的靶点，这通过基于凝胶和蛋白质组学的分析得到了证实。值得注意的是，PA功能化探针与对应的丙烯酰胺探针相比，表现出显著减少的脱靶结合，强调了它们在共价药物发现中增强靶点特异性的潜力。此外，VPA亲电体的模块化结构允许研究者在不显著影响靶蛋白结合能力的情况下容纳多样化的O-取代基。更重要的是，研究者利用这一独特的结构特征，成功引入了炔烃手柄、荧光素，甚至E3连接酶招募剂泊马度胺，从而构建了一种选择性的共价PROTAC。总而言之，本研究确立了VPA作为共价药物设计中一类独特且多功能的亲电体，在化学生物学、靶向共价抑制和蛋白质降解策略中具有广泛的应用前景。