《International Journal of Surgery》：Ultra-microskin as cytokine reservoirs promote diabetic wound healing: experimental research
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本研究介绍并验证了一种新型的“超微皮片”（Ultra-microskin）移植技术，用于治疗糖尿病足溃疡等慢性伤口。该技术通过自动化切割制备标准化的小尺寸皮片（0.4 × 0.4 mm），在1:10的扩展比下，其存活率和细胞因子（如VEGF-A、TGF-β1、EGF等）释放能力均优于传统微皮片，并能通过“可控损伤-因子释放”机制，在体内有效促进细胞增殖、血管新生、上皮形成并减轻炎症，从而加速糖尿病伤口的愈合，为慢性伤口治疗提供了新策略。
背景
糖尿病足溃疡等慢性伤口因持续的炎症反应和生长因子失衡而难以愈合。传统的微皮片移植技术面临活力不足、方向依赖性存活和旁分泌功能受限等问题。本研究旨在探讨使用超微皮片移植（约0.3 mm厚，表面积0.4 × 0.4 mm）在1:10扩展比下促进糖尿病伤口修复的可行性。
材料与方法
研究采用自动化皮肤切割设备制备超微皮片，并使用CCK-8检测、活/死染色、透射电镜和组织块培养法评估其与传统微皮片的活力。通过在体实验确定基于活力结果和“移植物间距理论”的最佳皮片尺寸。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量超微皮片释放的细胞因子，并评估其提取物对人包皮成纤维细胞（HFB）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和HaCaT细胞的迁移、增殖和成管能力的影响。最后，将0.4 mm超微皮片以1:10的比例移植到糖尿病大鼠全层皮肤缺损伤口，通过大体摄影、苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色、CD31/Ki-67免疫组化评估愈合效果，并在移植后第7天和第14天对伤口组织进行蛋白质组学分析。
结果
1. 超微皮片的制备与体外活力评估
自动化制备的尺寸≥0.4 mm的超微皮片，其活力与传统微皮片相当或更优。透射电镜显示自动化皮片切割边缘更整齐，真皮-表皮结构完整，而手动制备的皮片出现结构分离和线粒体肿胀。活/死染色显示，随着皮片尺寸增大，损伤面积百分比降低（M-0.2 mm: 94.30 ± 2.01%；M-0.4 mm: 35.98 ± 2.83%）。组织块培养显示，尺寸≥0.4 mm的皮片有显著的细胞迁出，且M-0.4 mm皮片的迁出细胞数与手动制备的H-1.0 mm皮片无显著差异。CCK-8检测证实活力随尺寸增加而提高，M-0.4 mm皮片的活力与H-1.0 mm皮片无显著差异。这些结果表明，自动化制备可产生具有尺寸依赖性活力的超微皮片，尺寸≥0.4 mm时其性能与传统微皮片相当。
2. 最佳超微皮片尺寸（0.4 × 0.4 mm）的确定
基于活力评估结果和“移植物间距理论”，研究确定了最佳尺寸。该理论旨在优化皮片尺寸，以在保证存活（活力>80%）和融合能力（间距≤5 mm）的同时，最大化供区面积扩展。计算和实验表明，0.4 mm × 0.4 mm的皮片在10倍扩展比下，移植物间距为0.86 mm，符合融合要求，且与组织氧有效扩散距离（0.1-0.2 mm）的理论最小值相关，对依赖伤口渗出液存活的皮片至关重要。体内移植实验证实，0.4 mm皮片在10倍扩展比下显示出最高的愈合率（90.1 ± 0.63%）、更佳的新生血管化和基底细胞增殖。因此，0.4 mm × 0.4 mm被确定为最佳超微皮片尺寸。
3. 0.4 mm超微皮片提取物促进伤口修复相关细胞功能并分泌多种细胞因子
研究发现，0.4 mm超微皮片的条件培养基能显著促进HUVEC、HaCaT和HFB细胞的增殖、迁移（划痕实验）以及HUVEC的成管能力。ELISA检测显示，与全层皮肤相比，超微皮片提取物中多种伤口愈合相关细胞因子的释放量显著增加，其中表皮生长因子（EGF）、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-10 (IL-10)、血管内皮生长因子-A (VEGF-A)、转化生长因子-β1 (TGF-β1) 的含量增加了两倍以上，且具有持续释放的特性。这表明超微皮片不仅作为物理覆盖物，更充当了“细胞因子库”，主动调控微环境。
4. 超微皮片加速糖尿病全层伤口愈合
在糖尿病大鼠模型中，移植0.4 mm超微皮片（1:10扩展比）可显著加速伤口愈合。移植后第3、5天观察到皮片存活和扩展，第7天实现移植物间融合与表皮连续性，第14天移植物完全融合并可见新生上皮形成，第21天接近完全愈合。组织学分析（H&E和Masson染色）显示了良好的表皮再生和胶原整合。免疫组化显示，早期和中期愈合阶段Ki-67阳性的增殖细胞显著增加，CD31阳性的新生血管在早期也显著增强。重要的是，H&E染色显示移植后第7、14、21天炎症细胞浸润极少，表明超微皮片有效控制了通常损害糖尿病伤口愈合的慢性炎症。
5. 超微皮片促进糖尿病伤口愈合的潜在机制
蛋白质组学分析揭示了潜在的分子机制。在移植后第7天和第14天，实验组与对照组分别有282个和345个差异表达蛋白。基因本体（GO）功能富集分析显示，这些蛋白显著富集于细胞骨架组织、上皮细胞发育、分化和角化等相关过程。基因集富集分析（GSEA）进一步显示，第7天实验组激活了与细胞骨架组织、上皮分化和白细胞介素-8 (IL-8) 产生相关的蛋白集，支持早期的细胞迁移、组织形成和炎症调节；第14天则激活了与上皮分化和血小板衍生生长因子受体信号通路相关的蛋白集，促进愈合后期的细胞增殖和血管新生。
讨论
研究提出的超微皮片技术，其尺寸介于传统微皮片和皮肤匀浆之间，旨在结合两者优点。它保留了微皮片的结构完整性和高活力，同时具备了皮肤匀浆的无方向性应用和高扩展比特性。超越结构作用，本研究提出了新颖的“细胞因子库”机制，证明超微皮片通过持续释放多种细胞因子主动调节伤口微环境。这种增强的细胞因子释放可能不仅仅是受损细胞的被动泄漏，还包括由切割损伤触发的主动上调，类似于“预处理”效应。研究观察到的剂量依赖性（0.4 mm效果优于0.2 mm）支持“可控损伤-因子释放”这一核心机制。尽管在糖尿病啮齿动物模型中取得了积极成果，但研究也存在局限性，包括体外活力评估的局限性、物种差异、缺乏长期结局数据以及对免疫反应（如巨噬细胞极化）表征不足等。未来需开发可扩展的输送方式（如悬浮喷雾系统）并验证于大型动物模型。
结论
本研究开发了一种新型超微皮片移植技术，通过标准化机械 fragmentation 制备富含生长因子的微移植物。该方法不仅克服了传统微皮片的方向性限制，还通过可控的细胞因子释放，动态高效地调节糖尿病伤口愈合。其背后的“可控损伤-因子释放”机制为慢性伤口修复提供了一种有效、标准化且具有临床转化潜力的策略。
