聚合物基数字荧光pH探针：设计、响应机制与活细胞逻辑运算应用

《Analyst》：Digital fluorescent pH probes: polymer-based design, fluorescence response, mechanism, functional tuning and application to logic operation in live cells

本文报道了一种基于温敏聚合物设计的数字型荧光pH探针，它能在微小pH变化（<1单位）下实现近完全的荧光开关，并成功应用于活细胞内的逻辑运算。该研究通过巧妙整合温敏、质子结合和环境敏感荧光单元，揭示了探针对pH变化的超灵敏响应机制源于质子诱导的聚合物三维结构变化引起的局部疏水性改变，为高灵敏度pH监测和分子逻辑运算提供了创新工具。

　　

荧光探针通过改变其荧光强度、寿命和最大发射波长等特性，来响应化学物种浓度或物理量的变化。在众多荧光探针中，荧光pH探针因其在溶液化学和生物学事件中的重要作用而被广泛应用。然而，传统探针通常需要约2个pH单位的跨度才能完成信号切换，这限制了其在需要高灵敏度监测场景中的应用。本文研究了一种能够实现“数字型”响应的聚合物基荧光pH探针，它能够在小于1个pH单位的微小变化下完成荧光开关，这得益于其独特的聚合物设计和工作机制。

数字荧光响应

研究首先展示了由N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N-[3-(二甲氨基)丙基]丙烯酰胺（DMAPAM）和环境敏感荧光单元DBD-AA共聚而成的共聚物 1 的功能。在50°C的固定温度下，该共聚物对pH变化表现出异常尖锐的响应。其荧光强度的变化可以在一个非常窄的pH范围内完成，响应曲线斜率（a值）高达3.69，远高于传统探针的典型值1。这表明仅需约0.52个pH单位的变化即可实现90.9%到9.09%的信号转变，因此被称为“数字”荧光pH探针。同时，其荧光寿命也表现出类似的尖锐响应，这为浓度不敏感的细胞内成像提供了可能。

工作机制

探针的卓越性能源于其聚合物设计。其核心机制涉及两个同时发生的物理化学变化：一是运行过程中探针附近微环境极性的改变；二是质子结合单元（DMAPAM）中氨基碱性的变化。在酸性条件下，质子化的DMAPAM单元使聚合物链亲水舒展，荧光单元周围极性高，发射长波长。随着pH升高，DMAPAM去质子化，聚合物链收缩，导致荧光单元周围的微环境极性降低（局部介电常数可从58降至7）。研究表明，DBD-DMAEA模型分子的质子化氨基的pK_a值会随溶剂极性降低而减小。因此，在聚合物1的运行过程中，随着pH升高和聚合物链收缩导致的局部极性下降，受体基团的实际pK_a值会左移。这种在pH变化过程中自身pK_a值的移动，最终汇合形成尖锐的“数字型”响应曲线。

功能调控

基于上述机制，研究者通过改变质子结合单元的结构，成功调节了数字荧光pH探针的工作pH范围。例如，使用碱性更强的N-[3-(二乙氨基)丙基]丙烯酰胺（DEAPAM）单元，探针2的pK_a值移至9.13；使用碱性较弱的吗啉基单元（MPAM）的探针3，其pKa值为6.16；而使用带有吸电子基的DMAcAPAM单元的探针4，则可在更低的pH范围（p_Ka ≈ 3.03）工作。此外，通过将质子结合单元从碱性胺类替换为酸性羧酸类（如丙烯酸，AA），实现了荧光开关方向的逆转。探针5在低pH下发出强荧光，同样表现出尖锐的响应。研究还表明，通过改变温敏单元（如用N-正丙基丙烯酰胺，NNPAM，替代NIPAM）可以调节探针的功能温度范围，使其更适用于哺乳动物细胞环境（37°C左右）。

在活细胞中的逻辑运算应用

利用数字荧光pH探针同时对pH和温度敏感的特性，研究者将其开发为分子逻辑门。共聚物9在溶液中的荧光强度和寿命仅在高温和高pH两个条件同时满足时显著增强，表现出典型的AND（与）逻辑功能。更重要的是，该逻辑门被成功应用于活HeLa细胞中。通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）观察，在细胞外pH和温度分别被控制为高（pH 8.0， 37°C）和低（pH 5.5， 22°C）的条件下，仅在细胞内环境同时为高pH和高温度时，才能观察到显著的荧光寿命延长（>7 ns）。这一结果清晰地证明了该聚合物逻辑门能在活细胞内执行精确的AND逻辑运算，能够区分微小的pH和温度差异。