编辑推荐：
推荐：本研究通过动物模型证实，在加工肉制品中添加多种营养保健成分（包括β-胡萝卜素、虾青素、ALA、DHA、儿茶素、鼠尾草酸、PTSO、植物乳杆菌(L. plantarum)后生元等），可协同发挥抗炎、益生元样作用及调节肠道菌群的功能，显著减少结直肠癌（CRC）宏观肿瘤的发展，为开发具有疾病预防功能的健康肉类提供了科学依据。
1. 引言
结直肠癌（CRC）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，是男性和女性中第三大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。虽然存在遗传风险因素，但大多数病例是散发性的，与环境和生活方式模式相关，其中饮食消费尤其重要。多项研究强调了健康饮食模式的保护作用，例如水果、蔬菜、膳食纤维、钙和维生素的摄入。
在促进CRC的生活方式因素中，加工肉和红肉的消费证据分别被认定为“令人信服”和“可能”。国际癌症研究机构（IARC）已将加工肉类列为1类致癌物。加工肉类是指经过腌制、熏制、腌制或发酵等加工转化的肉类。尽管减少肉类消费是降低全球CRC病例的理想策略，但公众对此类倡议的接受度不高，全球肉类消费量仍在增加。
本研究的团队先前工作已证明，在加工肉制品中添加植物化合物（如益生元纤维和多酚）是减少CRC发展的有效策略。其有效性至少部分归因于其调节肠道菌群和抗炎的特性。肠道菌群在CRC发展中起着核心作用，健康的肠道菌群能更好地发酵膳食植物来源的碳水化合物（益生元纤维），产生更多短链脂肪酸（SCFAs），如乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，从而促进肠道完整性并减少炎症。
此外，研究表明，香肠类配方在保留多种化合物方面具有卓越能力。肉类中的饱和脂质和添加植物油中的不饱和脂质创造了能够保留疏水性化合物的环境，而水分含量以及淀粉和纤维的保水能力则创造了能够保留亲水性化合物的环境。这些成分的混合物形成凝胶状基质，能够高度保留外源性脂质和多酚。
在本研究中，研究人员配制了五种不同的功能性肉制品，并在化学诱导的CRC大鼠模型（Rattus norvegicus）中进行了测试。这些肉制品以熟制香肠的形式制备，含有多种营养保健成分的混合物。
2. 方法
研究中生成了七个饮食组的大鼠队列。对照组仅摄入标准大鼠饲料。控制肉组摄入50%改良饲料和50%未添加营养保健成分的控制肉产品。五个功能性肉组摄入改良饲料和添加了不同营养保健成分混合物的功能性肉产品。营养保健成分的目标浓度基于文献中已证实的生物活性、欧洲食品安全局饮食指南以及肉制品制作过程中的技术和感官限制来确定。肉制品由研究中心的制造商标准方案进行混合和巴氏杀菌，呈香肠状稠度。每种营养保健成分的浓度通过高效液相色谱或气相色谱法确认。
所有动物实验均在经批准的设施中按照相关指南进行。使用先前建立的方案进行CRC的动物模型研究。大鼠被分为7组，每组10只，并分配到不同的饮食中。在饮食适应期后，开始CRC诱导。在实验结束时，对大鼠实施安乐死，并收集血液样本、量化小肠中的派尔集合淋巴结、称量盲肠鲜重、切除结肠并固定以量化宏观肿瘤。
为了进行肠道菌群分析，从每个盲肠中心取出200 mg盲肠物质，提取并纯化基因组DNA。通过PCR扩增16S rRNA基因的V3/V4区域并进行测序。原始序列处理后，在QIIME2环境中生成扩增子序列变体并进行分类学和系统发育分析。计算Alpha多样性（Shannon熵）和Beta多样性距离（基于Bray Curtis相异度）。使用MaAsLin2鉴定组间差异丰富的分类群。
其他统计均在GraphPad Prism软件中进行。使用ROUT检验识别异常值。使用Shapiro-Wilk检验测试每个变量的正态性。使用非参数Kruskal-Wallis检验测试两次暂时性结肠炎期间的体重变化。最终体重的差异通过Brown-Forsythe ANOVA检验。肿瘤数量和总肿瘤面积通过普通ANOVA检验。派尔集合淋巴结的差异通过普通ANOVA检验。相对盲肠重量通过Brown-Forsythe ANOVA检验。使用Tukey检验进行参数检验的多重假设校正，而使用Dunn检验进行非参数检验。调整后的p值低于0.05被认为具有显著性。
3. 结果
3.1 营养保健成分在功能性肉制品中的整合
初步评估了营养保健成分在烹饪后的稳定性。β-胡萝卜素、虾青素和DHA的保留率分别为25%、68%和50%。所有其余营养保健成分的损失均低于10%。通过调整这些损失，除β-胡萝卜素外，每种成分均达到了目标浓度。由于其保留率差，β-胡萝卜素在功能性肉制品中的最大浓度仅为约0.5 mg kg-1。
3.2 功能性肉制品对结肠炎和死亡的影响
分析的第一个参数是每个结肠炎期间体重的变化。在第一个结肠炎期间，观察到对照组和功能肉2组体重继续增加，而功能肉1、3、4、5组体重减轻。控制肉组似乎维持了相同体重，但该结果可能存在偏差，因为该组8只大鼠中有4只出现了如此严重的结肠炎，以致不得不在该周结束前被处死。在第二个结肠炎期间，观察到除功能肉1和2组外，所有组均出现显著体重减轻。所有在实验结束前被处死的大鼠都是由于出现了过度严重的结肠炎症状。
3.3 对癌症动物和对照动物体重的影响
在实验结束时比较了每组存活动物的体重。在癌症诱导组或健康对照组中，均未观察到组间体重的显著差异。与健康对照相比，所有组癌症诱导大鼠的平均体重普遍减少了50克以上。
3.4 肿瘤减少
在安乐死时，收集并固定每只大鼠的结肠，量化宏观肿瘤的数量和总肿瘤面积。所有组中100%的CRC诱导大鼠都出现了结直肠肿瘤。比较每组平均肿瘤数量，对照组、控制肉组、功能肉2、3、4、5组之间没有显著差异。功能肉1组的肿瘤数量少于所有其他组，尽管仅在与控制肉组、功能肉2、3、4组比较时才达到显著性。总肿瘤面积也遵循相同趋势，功能肉1组的总肿瘤面积少于其他组，尽管仅在与控制肉组比较时才达到显著性。
3.5 派尔集合淋巴结数量的减少
在癌症诱导大鼠中，观察到所有功能肉组的派尔集合淋巴结数量均少于两个对照组，而对照组之间没有差异。功能肉4和5组派尔集合淋巴结数量最低，而功能肉3组显著多于这两个组。每个健康对照组大鼠的平均派尔集合淋巴结数量少于5个，少于任何癌症诱导组。
3.6 对盲肠重量和肠道菌群的影响
观察到功能肉1和3组的盲肠平均重量高于其他组。这一差异与对照组、控制肉组、功能肉3和5组相比是显著的。功能肉4组盲肠重量居中，与任何其他组均无显著差异。
对每只大鼠盲肠微生物群组成的表征显示，不同的饮食显著调节了盲肠微生物群。从对照饲料转变为含控制肉的饲料影响最小，两组间的距离未达到显著性。相比之下，所有功能肉组均与两个对照组有显著差异。功能肉3组是与对照组差异最大的组，也是与所有其他功能肉组高度不同的组。尽管盲肠重量和微生物群组成存在显著差异，但Shannon熵的Alpha多样性没有观察到显著差异。
3.7 每种营养保健成分对微生物群组成的影响
研究比较了最低可能分类学水平上ASV的相对丰度。首先比较了对照组和控制肉组，以确定肉类消费的影响。共鉴定出9个分类群在两组间存在显著差异。最重要的变化包括某些细菌的减少和增加。接着，通过比较控制肉组和功能肉5组，研究了PTSO/植物乳杆菌混合物的影响。鉴定出3个分类群在两组间存在显著差异。最重要的变化包括几种细菌的减少。通过比较功能肉5和2组，研究了儿茶素和鼠尾草酸混合物的影响。鉴定出3个分类群在两组间存在显著差异，变化包括几种细菌的增加。通过比较功能肉5和4组，分析了ALA和DHA的Omega-3脂肪酸混合物的影响。鉴定出4个分类群在两组间存在显著差异，变化包括两种细菌的增加和两种细菌的减少。最后，通过比较功能肉5和3组，分析了β-胡萝卜素和虾青素类胡萝卜素混合物的影响。鉴定出17个分类群在两组间存在显著差异，最重要的变化包括多种细菌的增加和减少。
3.8 可能与肿瘤减少相关的肠道微生物群分类单元
由于功能肉1组是唯一经历肿瘤发展显著减少的组，并且该组与对照组相比具有高度不同的肠道微生物群组成，研究人员着手寻找可能使功能肉1组独特的差异分类单元。在比较功能肉1和控制肉组后，鉴定出13个差异分类群。显著变化包括多种细菌的增加和减少。研究人员追踪了先前研究表明可能与CRC发展相关的生理过程中涉及的物种在各组中的相对丰度。例如，Emergencia timonensis 在控制肉组中相对丰度较高，在功能肉1和5组中显著降低。Dielma fastidiosa 几乎只存在于对照组和控制肉组中。Streptococcus gallolyticus 在功能肉1组中显著更丰富。Roseburia intestinalis 在功能肉1组中显著更丰富。Bifidobacterium animalis 在所有组中丰度都非常低，除了功能肉1组。Bacteroides faecichinchillae 在功能肉1组中显著更丰富。Phocaeicola vulgatus 仅在功能肉1组中比控制肉组显著更丰富。
4. 讨论
由于仅在功能肉1组观察到肿瘤发展的减少，因此显然需要所有营养保健成分的协同作用才能实现这种减少。这些发现表明，肿瘤抑制需要同时激活多种生物机制，而这只有通过完整的功能性肉制品配方才能实现。在整个研究中，观察到了抗炎、益生元和微生物群调节作用。
在我们的动物模型中，肉类消费并未显著增加肿瘤发展，但确实加剧了结肠炎相关的体重减轻，表明其可能增加了肠道炎症。添加PTSO、植物乳杆菌、β-胡萝卜素、虾青素、ALA、DHA、儿茶素、鼠尾草酸、α-生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯可防止这种结肠炎相关的体重减轻，减少炎症，改变肠道微生物群，并减少肿瘤发展。未同时使用所有成分的混合物则未显示出肿瘤发展的减少。因此，肿瘤发展的减少很可能来自不同营养保健成分之间的协同效应、观察到的肠道微生物群调节以及功能性肉基质中Omega-3脂肪酸氧化的潜在预防。
功能肉2组似乎在两个时期都免受结肠炎相关的体重减轻，表明儿茶素/鼠尾草酸混合物具有保护作用。功能肉1组仅在第二个时期受到保护，这可能是因为只有这些动物在那个时间点的肿瘤负荷较低。所有功能肉组的派尔集合淋巴结数量显著减少，表明这种效应可能归因于PTSO和植物乳杆菌混合物。PTSO和植物乳杆菌后生元都具有强大的免疫调节特性，文献支持这些发现。
除了这两种营养保健成分直接抗炎活性外，数据还表明，其观察到的部分影响可能归因于它们对Emergencia timonensis的调节作用。该物种与三甲胺氧化物（TMAO）的生物合成有关，而TMAO与心血管疾病和CRC发展有关。肉类产品中富含左旋肉碱，研究发现，食用红肉饮食丰富的人群中，与TMA生物合成相关的基因丰度显著更高。数据显示，控制肉组的E. timonensis相对丰度最高，而所有功能肉组中其丰度均降至极低水平，这表明PTSO/植物乳杆菌混合物似乎降低了其丰度。
由于功能肉1和3组的盲肠显著增大，研究人员得出结论，这是由于这些组中存在β-胡萝卜素和虾青素。盲肠重量通常与更大的细菌生物量或更深的隐窝深度有关，因此是盲肠健康的一个标志。先前研究表明，膳食补充β-胡萝卜素和虾青素可调节小鼠肠道微生物组组成，虾青素甚至能促进肠道粘液分泌。体外发酵研究表明，添加β-胡萝卜素和虾青素可增加SCFA生物合成，并将群落组成转向更丰富的Roseburia和Ruminococcus属，同时增加Alpha多样性和乙酸生物合成。因此，可以为这两种化合物赋予益生元样特性。
类胡萝卜素混合物引起了盲肠微生物群组成的显著变化。在所有研究的营养保健组合中，添加类胡萝卜素混合物导致了微生物群组成的最大变化。一些分类群，包括Roseburia intestinalis和Bifidobacterium animalis，仅在功能肉1组中富集，表明这些分类群是通过摄入复杂的营养保健成分混合物而富集的，而不是对任何单一营养保健成分组产生反应。由于该组是唯一实现肿瘤发展显著减少的组，这些分类群的潜在影响不容忽视。R. intestinalis是一种众所周知的丁酸盐产生菌，与改善肠道健康和减少炎症有关。B. animalis已被证明对肠道完整性和炎症具有有益作用。
一个看似矛盾的结果是Streptococcus gallolyticus的丰度模式。它是一种机会性病原体，与CRC发展密切相关。数据表明，它可能在功能肉1和4组中富集，这表明S. gallolyticus可能由于Omega-3脂肪酸混合物的添加而增殖。该物种在研究中的作用及其对观察到的肿瘤发展的影响尚不完全清楚。
虽然本研究中使用的营养保健成分浓度在安全消费限值内，但研究人员需要确保研究中使用的化合物混合物不会对动物的健康产生负面影响。所有健康对照大鼠达到了可比的体重，并且没有发展出肿瘤、派尔集合淋巴结数量升高或任何其他负面健康影响的迹象。因此，可以确认本研究中使用的营养保健组合对啮齿动物受试者的健康没有观察到负面影响，也没有在未诱导CRC的情况下影响本研究测量的参数。
还应注意，由于功能肉1组是唯一含有α-生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯的组，这些抗氧化剂的作用不容忽视。已知Omega-3脂肪酸在烹饪过程中可能被氧化。脂溶性抗氧化剂（如α-生育酚、抗坏血酸棕榈酸酯、类胡萝卜素，甚至儿茶素）的添加可能会保护Omega-3脂肪酸混合物免受氧化，从而增强其在功能肉1组中的抗肿瘤特性。
综合来看，数据支持一个多因素的机制模型：功能肉1组中的肿瘤抑制源于微生物群调节、炎症控制以及可能其他未研究途径的协同作用。PTSO/植物乳杆菌混合物似乎减轻了粘膜免疫激活，可能是通过直接抑制细胞因子和减少产生TMAO的细菌E. timonensis的丰度。同时，类胡萝卜素混合物诱导益生元样效应，增加盲肠生物量，并选择性富集丁酸盐产生菌。此外，儿茶素/鼠尾草酸混合物可防止溃疡性结肠炎造成的损伤。这些微生物群驱动的变化可能减少了支持肿瘤发生和发展的炎症和代谢微环境。尽管每种营养保健混合物在单独作用时都能产生可测量的生物效应，但只有它们的联合作用才能同时调节炎症、微生物组成和结肠炎症状，从而显著减轻结直肠肿瘤负荷。
5. 结论
在本研究的动物模型中，肉类消费并未显著增加肿瘤发展，但确实加剧了结肠炎相关的体重减轻，表明其可能增加了肠道炎症。添加PTSO、植物乳杆菌、β-胡萝卜素、虾青素、ALA、DHA、儿茶素、鼠尾草酸、α-生育酚和抗坏血酸棕榈酸酯可防止这种结肠炎相关的体重减轻，减少炎症，改变肠道微生物群，并减少肿瘤发展。未同时使用所有成分的混合物则未显示出肿瘤发展的减少。因此，肿瘤发展的减少很可能来自不同营养保健成分之间的协同效应、观察到的肠道微生物群调节以及功能性肉基质中Omega-3脂肪酸氧化的潜在预防。先前的研究已证明了功能性肉制品保留特定营养保健成分、将其递送给宿主并实现促进健康的生理反应的可行性。本研究通过广泛的营养保健成分证实了这种可行性，并表明在同一功能性肉制品中混合多种不同化合物可能是一种特别有趣的策略。
