元半胱天冬酶（Metacaspases）在海洋硅藻热应激细胞响应中的关键作用：连接程序性细胞死亡与温度适应性的新视角

《New Phytologist》：Metacaspases contribute to the cellular response to heat stress in a marine diatom

本文揭示了海洋硅藻在应对气候变暖引发的热浪（HW）时，其细胞内部的元半胱天冬酶（Metacaspases）所扮演的双重且关键的角色。研究表明，这类与凋亡相关的蛋白酶不仅参与环境胁迫诱导的细胞死亡（PCD），更在硅藻适应高温、增强热耐受性方面发挥核心的生存支持功能。研究通过CRISPR-Cas9技术构建了基因敲除（KO）突变体，结合生理生化分析，阐明热应激导致活性氧（ROS，如H2O2）积累，进而可能激活元半胱天冬酶依赖的信号通路以决定细胞命运。这项工作为理解海洋初级生产者在气候变化下的适应机制提供了新的分子基础。

　　

引言

海洋温度因全球气候变化而持续上升，其中被称为海洋热浪（HW）的极端温度波动事件正变得越来越频繁和剧烈。海洋热浪通常被定义为海水温度在长时间（数天至数月）内显著高于多年平均值。这类事件对海洋生物，尤其是作为全球初级生产重要贡献者的浮游植物群落，构成了严重威胁。硅藻是浮游植物中多样性最高、地理分布最广的类群之一，对全球初级生产力的贡献可达20%。然而，关于硅藻应对海洋热浪的分子机制，特别是其热耐受性（thermotolerance）的调控基础，目前尚知之甚少。

近年来，一类结构类似于动物细胞凋亡执行者半胱天冬酶（caspases）的蛋白酶——元半胱天冬酶（Metacaspases, MC），在植物和单细胞生物的热应激响应中显示出新的作用。传统上，元半胱天冬酶因其与细胞凋亡的关联而被熟知，但最新研究表明，它们在应激条件下的蛋白质稳态调节和生存支持中也扮演着重要角色。在模型硅藻三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中，存在五个元半胱天冬酶基因，其中三个（PtMCA-IIIa, PtMCA-IIIb, PtMCA-IIIc）属于III型，在藻类中普遍存在。本研究旨在利用实验室模拟的海洋热浪体系，探究元半胱天冬酶在驱动海洋硅藻热耐受性中的具体功能。

材料与方法

研究以三角褐指藻（CCMP2561）为模型。细胞在18°C、16小时光照:8小时黑暗循环的条件下，于添加f/2培养基的过滤海水中培养。热浪处理通过将培养物转移至33°C并维持72小时，随后移回18°C进行恢复来实现。

研究采用了多种生理和分子生物学方法：利用流式细胞术对细胞丰度、细胞死亡（采用Sytox Green染色）和细胞内H₂O₂水平（采用BES-H₂O₂探针）进行量化；使用水下脉冲振幅调制荧光仪（Water-PAM）测量光合系统II的最大光化学效率（F_v/F_m）。为了研究元半胱天冬酶的功能，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在已有的PtMCA-IIIc单敲除（KO）株系基础上，进一步构建了PtMCA-IIIb和PtMCA-IIIc的双敲除（ΔMCA-IIIbc）以及PtMCA-IIIa、IIIb、IIIc的三敲除（ΔMCA-IIIabc）突变体。通过体外酶活实验，使用荧光底物Ac-VRPR-AMC检测了野生型和各类突变体细胞裂解物中的元半胱天冬酶蛋白水解活性。此外，还通过定量PCR（qPCR）分析了热应激下PtMCA-III基因的表达变化，并应用抗氧化剂谷胱甘肽（GSH）和N-乙酰半胱氨酸（NAC）来探究活性氧（ROS）在热应激响应中的作用。

结果

三角褐指藻对高温的生理响应及热浪实验体系的建立

研究首先确定了三角褐指藻对温度升高的敏感性。当温度从18°C升至23°C和28°C时，生长速率分别从0.75 ± 0.03 μ d^-1下降至约0.55 ± 0.05 μ d^-1。转移至33°C和35°C则导致生长速率为负值。细胞死亡分析显示，暴露于33°C两天后，约18%的细胞死亡，而在35°C下则高达98%。因此，33°C被确定为引发生理剧变但非完全致死的热应激温度阈值。

基于此，研究建立了一个包含72小时33°C热应激期及随后恢复期的实验室热浪模拟体系。在整个过程中，细胞的生理响应可划分为三个阶段：1）热浪期（HW，第1-3天）：生长停滞，细胞死亡开始逐渐上升，光合效率（F_v/F_m）急剧下降。2）潜伏期（LP，第3-6天）：生长持续停滞，细胞死亡在移回18°C后达到峰值（例如野生型在第6天达到约55%），表明应激效应在热刺激结束后仍在累积。3）恢复期（RP，第6-9天）：存活亚群开始恢复生长，光合效率回升，群体中的细胞死亡比例下降。

元半胱天冬酶在热应激响应中的表达与功能缺失突变体的构建

qPCR分析显示，三个PtMCA-III基因在热应激（33°C）下均出现上调表达，但表达时序不同，提示它们可能参与热应激响应。为了揭示其功能，研究成功构建了元半胱天冬酶活性逐级降低的突变体系列。体外酶活测定表明，单敲除（ΔMCA-IIIc）、双敲除（ΔMCA-IIIbc）和三敲除（ΔMCA-IIIabc）突变体的蛋白酶活性依次显著降低，其中三敲除突变体的活性几乎完全丧失。

元半胱天冬酶三敲除突变体对热应激高度敏感

与野生型相比，PtMCA-III三敲除突变体表现出对高温的显著敏感性。它们的生长热响应曲线左移，在28°C时生长即被严重抑制，而野生型在此温度下仍能维持一定生长。更重要的是，突变体诱导细胞死亡的“临界温度”降低了约5°C，在28°C时细胞死亡率就达到约40%，而野生型在33°C时才出现显著死亡。

在标准热浪处理中，突变体在整个过程中都表现出更高的细胞死亡比例和更迟缓的生长恢复。这种热敏感表型是特异的，因为突变体在面对由溴化氰（BrCN）或癸二烯醛（DD）等化学信息素诱导的细胞死亡时，与野生型并无显著差异。此外，突变体在稳态下具有更高的细胞内H₂O₂基础水平，并且对外源添加的H₂O₂处理表现出更高的敏感性，导致更严重的细胞死亡。

热应激响应由H₂O₂积累介导并与元半胱天冬酶功能相连

研究发现，热应激（33°C）导致细胞内H₂O₂在6.5小时内积累约1.6倍。虽然突变体在热应激下H₂O₂积累幅度与野生型相似，但由于其基础水平更高，最终达到的氧化胁迫程度更甚。这一发现将热应激、ROS积累和元半胱天冬酶功能联系起来。为了验证ROS在热致死中的作用，研究在热应激前对野生型细胞施加了抗氧化剂GSH或NAC。结果显示，抗氧化处理显著提高了细胞在热浪期间的存活率，将细胞死亡峰值从约45%降低至25-26%，并促进了细胞丰度的恢复。

讨论

元半胱天冬酶在硅藻热耐受性中的促生存角色

本研究发现，元半胱天冬酶在硅藻应对热浪时扮演了关键的促生存角色，而不仅仅是细胞死亡的执行者。三敲除突变体热敏感表型的出现，以及其热响应阈值的改变，强有力地证明了这些蛋白酶是硅藻热耐受性调控网络的核心组成部分。这种功能与在植物、酵母和绿色藻类中的发现一致，表明元半胱天冬酶在真核生物热应激响应中的作用可能是进化上保守的。研究提示，三角褐指藻中不同的元半胱天冬酶成员可能具有功能分工，有的主要参与死亡信号传导，而有的（如本研究揭示的）则在适应胁迫、维持细胞生存中至关重要。类似酵母Yca1元半胱天冬酶那样，通过钙调蛋白结合等机制在蛋白水解活性和分子伴侣样活性之间切换的功能可塑性，也可能是硅藻元半胱天冬酶精细调控细胞命运的机制之一。

硅藻对热应激的细胞响应由H₂O₂生成介导

热应激导致光合系统II（PSII）严重受损和光合效率下降，这可能促进了ROS（如H₂O₂）的产生。本研究证实，热应激确实引发了细胞内H₂O₂的积累，并且这种ROS的生成与细胞死亡诱导紧密相关。元半胱天冬酶三敲除突变体对氧化胁迫的高度敏感性，以及抗氧化剂能有效缓解热致死现象，共同支持了一个模型：热应激诱导的ROS积累，激活了下游依赖元半胱天冬酶的信号通路，该通路进而调控细胞的命运抉择——走向死亡或启动适应与修复程序。此前研究已发现PtMCA-IIIc是氧化还原敏感的，其活性受ROS水平调节，这为上述模型提供了分子层面的连接点。

结论与展望

本研究通过建立一个模拟海洋热浪的实验室体系，系统阐述了海洋硅藻三角褐指藻在应对瞬时高温胁迫时的生理动态和分子机制。研究首次揭示了元半胱天冬酶在该过程中发挥的关键的、促生存的作用，并将热应激、ROS信号和元半胱天冬酶功能联系起来，阐明了它们共同调控硅藻热耐受性的通路。这些发现增进了我们对海洋初级生产者如何适应气候变化下日益频繁的热浪事件的理解。考虑到海洋热浪在时空范围内的不断扩张，未来需要进一步深入研究驱动藻类热适应的分子组件，以预测和评估气候变化对海洋生态系统结构和功能的深远影响。