《Plant Biotechnology Journal》：Enhancing CRISPR/Cas-Mediated Gene Knockout With Short Non-Homologous Oligonucleotides
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本研究报道了一种在莱茵衣藻中显著提升CRISPR/Cas介导基因敲除（KO）效率的新策略。研究者通过将CRISPR-Cas基因编辑试剂与短链双链非同源寡脱氧核苷酸（dsNHO）共递送，可使基因敲除效率提升高达100倍。这一被命名为“非同源寡核苷酸增强”（NOE）的现象，主要通过细胞内的DNA双链断裂（DSB）感受器KU70/80（KU）异二聚体介导，与所用Cas核酸酶类型、靶点基因位点及藻株无关。该策略能扰乱细胞的DSB感知通路，将DNA修复平衡从典型的非同源末端连接（c-NHEJ）转向更易出错的微同源介导末端连接（MMEJ），从而产生更多导致基因功能丧失的插入/缺失（indel）突变。这项工作为在莱茵衣藻乃至更广泛的生物体系中提高基因敲除效率提供了一种通用、高效且经济的方法。
引言
莱茵衣藻是一种模型绿色微藻，在作为重组蛋白和高价值化学品生产的可持续生物工厂方面具有巨大工业潜力。高效的基因组编辑工具对于重新设计该生物体以用于合成生物学应用至关重要。CRISPR-Cas编辑技术已被用于莱茵衣藻的基因敲除、转基因敲入和精确基因编辑。然而，CRISPR/Cas介导的基因敲除效率较低，这阻碍了途径工程和功能基因组学研究。通常，CRISPR核糖核蛋白（RNP）复合物诱导的序列特异性DNA双链断裂主要由营养细胞中的典型非同源末端连接（c-NHEJ）DNA修复途径修复，该途径由KU70/80（KU）异二聚体复合物介导。但此过程易出错，尤其是在重复DNA切割发生时，最终会在CRISPR靶位点产生短插入和缺失。在莱茵衣藻中，CRISPR-RNP诱导的敲除效率相对较低，范围从10-6到5.2%。为提高敲除效率，通常可将CRISPR RNP与双链DNA抗生素抗性盒共递送，或使用具有同源臂的单链寡核苷酸，但这些方法存在选择标记基因有限或整合序列大小受限等问题。本研究的初衷是探索将具有互补黏性末端的双链非同源寡脱氧核苷酸精确敲入到Cas12a产生的交错DSB中，但意外发现短链dsNHO的共递送可大幅提升基因敲除效率。
结果
短链非同源寡核苷酸（dsNHO）能显著增强莱茵衣藻中的基因敲除效率
研究者以莱茵衣藻cc-1883 cw15菌株的FKB12基因为靶点，该基因功能丧失会导致对雷帕霉素的抗性。当单独递送靶向FKB12的Cas12a RNP时，平均FKB12敲除效率仅为0.29%。然而，当将1 mM的、具有5‘黏性末端（5CO）的24-bp dsNHO与Cas12a RNP共递送时，敲除效率增加了约150倍，达到44.5%。值得注意的是，单独使用5CO未回收到任何雷帕霉素抗性菌落。对随机选择的抗性菌落中Cas12a切割位点周围基因组区域进行测序分析，发现切割位点存在随机缺失、微同源介导缺失以及dsNHO插入的混合情况，但未观察到5CO的无疤痕精确敲入。
为了解敲除增强是否与dsNHO末端结构有关，研究者还设计了具有非互补3’黏端（3NO）和平末端（BE）的dsNHO。结果显示，两者均能像5CO一样增强FKB12敲除效率。其中，平末端dsNHO在群体水平上被插入预期DSB的频率显著高于5CO和3NO，这表明尽管Cas12a产生交错DSB，但莱茵衣藻的DNA修复机制更倾向于整合平末端dsNHO。此外，dsNHO内部序列的GC含量会影响其增强效果，GC含量较低的序列增强效果更佳，且这种增强作用依赖于dsNHO的浓度，在约50%的敲除效率时达到平台期。
非同源寡核苷酸增强（NOE）现象的特征与机制探究
这种在哺乳动物细胞中也有报道的、因NHO将细胞转向易错修复而提升敲除效率的现象，被称为“非同源寡核苷酸增强”（NOE）。研究者进一步探究了NHO的最佳长度和链类型。共递送短单链NHO未能显著提高敲除效率，而长单链NHO（如96 nt）则可以。对于双链NHO，24 bp长度足以诱导NOE，且更长的dsNHO并未进一步增加效率。实验表明，NOE依赖于双链DNA结构，因为长单链NHO有更大潜力通过自退火形成双链区域。不支持形成强二级结构的单链NHO（如48 nt胞嘧啶同聚物）无法引起同等程度的敲除增强，脱氧核苷酸（dNTP）或长链双链DNA类似物（聚脱氧肌苷-脱氧胞苷酸）也未观察到显著的NOE效应。此外，在莱茵衣藻中，共递送不同长度或二级结构的RNA未能像在人类细胞中那样刺激NOE。
化学修饰实验发现，在dsNHO的5‘和3’末端添加硫代磷酸酯（PT）修饰几乎完全消除了NOE，而在dsNHO中间进行PT修饰则略微增强了敲除效率。这些观察结果表明DNA末端的可及性可能很重要，暗示了DNA末端结合蛋白的参与。具体而言，外源dsNHO可能作为诱饵，将DNA修复蛋白（如KU异二聚体）从Cas12a切割位点转移开，从而导致更易出错的修复并提高敲除效率。KU异二聚体结合dsDNA所需的最小长度约为14-18 bp，这解释了为何短于24 bp的dsNHO无效，以及NOE幅度依赖于所用dsNHO浓度。
DNA修复途径在NOE中的关键作用
为了验证上述假设，研究者通过敲入aphVIII盒产生了ku70、ku80、mre11和polq突变体。当单独递送Cas12a RNP时，在ku突变体中观察到比野生型高约200倍的敲除效率，而在polq1和mre11突变体中敲除效率很低。在kupolq双突变体中，敲除效率的增加被消除。这强烈表明c-NHEJ是参与Cas12a介导DSB修复的主要途径，在其缺失时会发生易错的MMEJ介导修复。
当dsNHO与Cas12a RNP共递送时，在所有菌株中均观察到敲除效率的显著增加。通过计算相对于各自仅用Cas12a处理的敲除效率变化倍数，发现在野生型、polq1和mre11突变体中观察到200至500倍的变化，而在ku和kupolq突变体中，相对于野生型，敲除增强的倍数变化显著降低。这强烈表明KU异二聚体是NOE所必需的。对回收细胞群体的扩增子测序分析显示，在仅用Cas12a转染的ku突变体中，缺失率显著增加，这与KU缺失允许易错MMEJ修复发生的观点一致。当共递送dsNHO时，所有菌株的插入和缺失合并频率均增加，但ku突变体中的插入频率显著降低，表明KU异二聚体是莱茵衣藻中dsNHO插入DSB的主要因素。
NOE的普适性验证
研究发现，使用Cas9 RNP也能观察到NOE现象。然而，与Cas12a相比，Cas9产生的敲除中超过一半涉及dsNHO在DSB处的串联插入，而Cas12a仅约15%。这表明Cas12a和Cas9的结合动力学或切割产物释放的差异可能影响DSB处的DNA修复结果。Cas9产生的小插入缺失（1-2 bp）在Cas12a RNP中未观察到，而Cas12a则产生4-15 bp的MMEJ介导缺失。这表明Cas12a介导的交错DSB可能促进末端切除，从而增加MMEJ修复相对于c-NHEJ的频率。但无论如何，添加dsNHO都会增加靶向DSB处的易错修复。
NOE现象在其他莱茵衣藻基因位点（如叶绿体定位蛋白基因FTSY和SRP43）和其他无细胞壁藻株（cc-3491、cc-4533和UVM4）中也得到证实。共递送dsNHO使得原本效率极低（<0.04%）的敲除能够被检测到，并且在不同藻株中均能显著增强基因敲除效率，尽管增强程度因菌株而异，表明不同菌株可能因DNA修复途径效率不同而对外源DNA具有不同的“敏感性”。
讨论
本研究表明，长度至少为24 bp的dsNHO与Cas12a或Cas9 RNP共递送时，可将基因敲除效率提升高达两个数量级，而能够形成DNA二级结构的单链NHO也能产生此效果。这与人类细胞中的观察存在定性和定量差异，可能归因于DSB修复相关基因的结构和/或功能差异。研究者提出的“诱饵”模型认为，dsNHO将DNA修复蛋白（主要是KU异二聚体）从CRISPR-Cas诱导的DSB处隔离，从而将DNA修复从无误修复转向易错途径，进而增加CRISPR切割位点的插入缺失频率。高浓度的dsNHO可与大多数可用的KU异二聚体相互作用并最终使其饱和，将其从CRISPR-Cas诱导的DSB转移开，这些被释放的DSB随后将主要由易错的MMEJ途径修复。然而，在ku突变体中敲除效率仍能提高三倍，表明其他dsDNA结合蛋白也可能对NOE有贡献。
“诱饵”效应不可能是增强敲除效率的唯一现象，因为也观察到dsNHO插入靶向DSB的增加。这可以通过dsNHO在靶向DSB附近的邻近性及其随后通过c-NHEJ途径的整合来解释，从而导致移码突变并提升敲除效率。研究中使用的是非磷酸化寡核苷酸，24 bp的dsNHO足以诱导NOE，且敲除效率不随长度增加至96 nt而进一步提高，这表明更长的dsDNA也可能在莱茵衣藻中有效触发NOE。
结论与展望
在共转染dsNHO与CRISPR-Cas RNP的所有实验中，均观察到基因敲除效率相比单独使用RNP有显著提升（从5倍到两个数量级）。这些数据清楚地表明，添加dsNHO可以增强甚至挽救低效的CRISPR RNP，且与所使用的核酸酶或靶点基因位点无关。位点特异性因素，如染色质可及性、gRNA有效性、局部DNA修复动力学和细胞周期，都可能造成敲除提升效率的差异。任何使用外源DNA的基因编辑技术都可能导致脱靶整合，从而在基因组其他位置产生不必要的突变。为规避此问题，建议生成三个或更多独立的基因敲除株系以验证后续表型。鉴于c-NHEJ途径是基因敲除的主要参与者，未来寻找莱茵衣藻KU异二聚体的高效抑制剂至关重要。这种抑制剂可以瞬时抑制c-NHEJ，从而提升该生物体中的基因编辑效率。
