Bannakunin：一种双重靶点的Kunitz抑制剂，同时作用于抗凝（FXa/XIIa）和抗血小板（α2β1/P2Y12）途径

《Cellular & Molecular Biology Letters》：Bannakunin: a dual-target Kunitz inhibitor bridging anticoagulation (FXa/XIIa) and anti-platelet (α2β1/P2Y12) pathways

血栓症防治需求推动黑蝇唾液Kunitz型抑制剂Bannakunin研究，其通过抑制FXa、FXIIa及蛋白酶活性发挥双重抗血栓作用，同时调节血小板α2β1整合素和P2Y12受体介导的信号通路，在动物模型中有效抑制血栓形成且无出血风险，为新型抗血栓药物开发提供模板。

　　

摘要

背景

血栓形成是全球发病率和死亡率的主要原因之一。因此，人们一直在寻找有效且安全的抗血栓药物。吸血动物进化出了多种唾液中的生物活性成分来对抗宿主的止血反应。我们的目标是发现具有双重抗血小板和抗凝血活性的抗血栓剂。

方法

从吸血黑蝇Simulium bannaense的唾液腺互补DNA（cDNA）文库中克隆出一种新型的单Kunitz结构域抑制剂（Bannakunin）前体，并在大肠杆菌中表达。重组Bannakunin通过固定化金属亲和层析和高效液相色谱法进行纯化。其二级结构通过圆二色光谱法确定。抗血栓活性通过颈动脉血栓形成和尾静脉血栓形成模型进行评估。抑制活性通过丝氨酸蛋白酶抑制试验、表面等离子体共振（SPR）和分子对接技术进行测定。其对血小板的调控作用通过血小板聚集、血栓收缩和血小板扩散试验进行评估。随后，通过Western blotting、酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术研究了其靶受体和信号通路。

结果

重组Bannakunin在小鼠FeCl₃诱导的颈动脉血栓形成和卡拉胶诱导的尾静脉血栓形成模型中表现出显著的抗血栓效果，并且没有引起出血并发症。同时，Bannakunin显著延长了人血浆中的凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）。进一步的研究表明，Bannakunin能够抑制凝血因子FXa和FXIIa的活性，以及弹性蛋白酶、胰蛋白酶和血浆激肽释放酶的活性，但不会抑制凝血酶和FXIa的活性。表面等离子体共振研究表明，Bannakunin与人弹性蛋白酶（KD：1.95 nM）和人FXa（KD：42.9 nM）的活性位点结合亲和力最高。有趣的是，我们观察到Bannakunin显著抑制了血栓收缩以及血小板聚集和扩散。在机制上，Bannakunin通过下调整合素α2β1介导的Src/Syk/PLCγ2信号通路以及Ca²⁺、TXB₂和ATP的释放来抑制胶原诱导的血小板活化。此外，Bannakunin通过阻断P2Y12受体，降低PI3K/Akt信号通路的活化，并上调cAMP的水平，从而有效抑制ADP诱导的血小板活化。

结论

这些发现加深了我们对Kunitz型抑制剂抗血小板功能的理解，并将Bannakunin视为开发新型抗血栓药物的有希望的分子模板。

图形摘要