接种产毒与生物防治真菌的玉米饲料研究：黄曲霉毒素从饲料向牛奶与酸奶的转移

《Mycotoxin Research》：Maize inoculation with aflatoxigenic and biocontrol fungi - toxin transfer from feed into milk and yoghurt

本研究探讨了使用生物防治真菌（非洲哈茨木霉与非产毒黄曲木霉）替代产毒黄曲木霉处理玉米饲料，能否有效阻断黄曲霉毒素B1（AFB1）向牛奶及其制品（如酸奶）的转移。结果表明，生物防治处理能完全阻止AFB1及其代谢物M1（AFM1）和环匹阿尼酸（CPA）进入牛奶，而仅使用合法限量的AFB1污染饲料即可导致牛奶中AFM1超标。这揭示了当前法规下的潜在风险，并证明了生物防治策略在保障乳制品安全方面的应用潜力。

　　

黄曲霉毒素是真菌产生的剧毒致癌物，其中黄曲霉毒素B₁（AFB₁）尤为危险。当奶牛食用了被AFB₁污染的饲料后，它会在奶牛体内转化为毒性稍弱但仍有害的代谢物——黄曲霉毒素M₁（AFM₁），并随乳汁排出。这使得牛奶及以其为原料的乳制品成为人类，尤其是婴幼儿，暴露于黄曲霉毒素的重要途径。为了保障食品安全，各国都设定了饲料和牛奶中AFB₁和AFM₁的法定限量。然而，一个令人担忧的问题是：即使在饲料AFB₁含量符合现行法规标准的情况下，产出的牛奶是否就一定能保证安全？此外，面对饲料中普遍存在的产毒真菌污染，除了传统的化学方法，有没有更环保、安全的生物防治手段来从源头上减少毒素的产生？这些问题直接关系到全球乳制品供应链的安全与消费者的健康。

为此，研究人员在《Mycotoxin Research》上发表了一项研究，旨在通过一个“从农场到餐桌”的综合实验来探究这些问题。他们不仅关注饲料环节，还追踪了毒素如何一路“旅行”到最终产品——酸奶中。研究团队重点关注了两种生物防治真菌：非洲哈茨木霉（Trichoderma afroharzianum）和非产毒黄曲木霉（Aspergillus flavus），将它们与一株已知的产毒黄曲木霉进行对比，系统地评估了这些处理对玉米饲料中真菌毒素形成的影响，以及随后毒素从饲料转移到牛奶，并在酸奶加工过程中的归宿。

为开展研究，作者主要运用了以下关键技术方法：1）动物饲养实验：将16头高产荷斯坦奶牛分为四组（对照组、两种生物防治组、产毒真菌组），通过胶囊灌胃方式，连续14天给予用不同真菌菌株接种处理的玉米粉。2）高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析：用于精确测定饲料、牛奶和酸奶样品中的多种真菌毒素，特别是AFB₁、AFM₁和环匹阿尼酸（cyclopiazonic acid， CPA）的含量。3）酸奶加工模拟：使用从实验奶牛获得的天然含AFM₁的原料奶，在实验室条件下采用两种商业酸奶发酵剂（Yo-Mix 601和Yo-Mix 215）进行标准化酸奶生产，以模拟真实加工条件。4）体外模型实验：在柠檬酸存在下对纯AFM₁标准品进行处理，模拟酸性条件下的水合反应，以探究其潜在的降解路径。

研究结果部分：

受污染的饲料

对接种真菌的玉米进行分析发现，产毒黄曲木霉（ATox组）处理导致了显著的AFB₁和AFB₂产生，而两种生物防治菌株（BCA和BCT组）的处理下未检测到黄曲霉毒素。产毒菌株ATox和非产毒生物防治菌株BCA均产生了CPA，但BCT处理组中未检测到CPA。其他筛选的真菌毒素仅检测到痕量的伏马菌素B₁（fumonisin B₁， FB₁）和玉米赤霉烯酮（zearalenone， ZEN），这归因于初始玉米的背景污染。所有实验组奶牛的日粮总混合日粮（total mixed ration， TMR）中均未检出AFB₁或CPA，表明额外的毒素摄入可忽略不计。在整个喂养试验期间，未观察到任何处理对奶牛的基本健康和生产性能参数产生明显不利影响。

牛奶分析

仅在暴露于产毒黄曲木霉（ATox组）的奶牛牛奶中检测到了黄曲霉毒素（具体为AFM₁）。尽管ATox和BCA组的奶牛每日通过胶囊摄入了相当量的CPA（分别为40.2微克和73.5微克），但在任何喂养组的牛奶中均未检测到CPA。这表明白日摄入的CPA向牛奶的转移率极低（计算表明未代谢CPA的转移率不超过2.3%）。AFM₁在牛奶中的水平在试验开始约3天后达到稳定状态，浓度在73至152纳克/升之间。基于稳态期数据计算，从饲料AFB₁到牛奶AFM₁的平均转移率为3.8% ± 0.9%，个体间转移率在2.72%至4.67%之间。数据显示，AFM₁的转移率有随着日产奶量增加而升高的趋势。重要的是，研究数据表明，即使奶牛饲料中的AFB₁污染水平在法律限值（5微克/千克干物质）内，产出的牛奶中AFM₁含量也可能超过欧盟规定的50纳克/千克的限量标准。

用天然污染牛奶生产的奶制品分析

AFM₁向AFM_2a的转化与分析

在模型实验中，将AFM₁置于含1.5%柠檬酸的溶液（H₂O/乙腈， 50/50， v/v）中60°C处理，观察到AFM₁信号强度下降了约50%，同时出现了与假设的AFM₁水合产物（AFM_2a）质量数相符的新色谱峰。这表明AFM₁在酸性条件下可能发生类似AFB₁转化为AFB_2a的水合反应。

AFM₁在酸奶制备过程中的稳定性

然而，在使用含AFM₁的天然污染原料奶进行真实酸奶生产时，并未观察到AFM₁的显著降解。酸奶中的AFM₁回收率几乎为100%（浓度在89至114纳克/升之间），与原料奶中的含量相当。同时，在酸奶样品中也未检测到模型实验中观察到的AFM_2a信号。这说明在酸奶生产所使用的具体酸性发酵条件下，不足以引发AFM₁的显著水合降解。

总体讨论与结论

本研究证实，在饲料AFB₁污染处于法律限值内的“最坏情况”下，牛奶中AFM₁超标是可能的。观察到的AFM₁转移率（3.8%）略高于先前使用纯AFB₁标准品添加饲料的研究（约2.4%），这可能是由于天然污染的玉米基质中可能存在未被常规方法检测到的“掩蔽态”AFB₁形式，或者真菌侵染增强了AFB₁的吸收。研究还发现AFM₁转移率与奶牛产奶量呈正相关趋势，结合气候变化可能增加产毒真菌的发生，未来高产奶牛可能导致牛奶中AFM₁问题加剧。

在解决方案方面，应用两种生物防治真菌（非洲哈茨木霉和非产毒黄曲木霉）处理玉米，能有效阻止AFB₁及其向AFM₁的转移，且未观察到对奶牛健康的不利影响。同时，也未检测到CPA向牛奶的转移。值得注意的是，非洲哈茨木霉本身不产生CPA，因此从避免引入其他毒素风险的角度看，它可能是比非产毒黄曲木霉更优的生物防治选择。

最后，关于乳制品加工环节，尽管模型实验证明AFM₁在强酸条件下可能发生水合降解，但在真实的酸奶生产工艺条件下，这种降解并未发生，AFM₁在酸奶中稳定存在。这意味着通过常规酸奶发酵加工来降低污染牛奶中AFM₁含量的希望落空，加工过程并不能作为有效的去毒手段。

综上所述，这项研究具有重要意义：它揭示了即使在现行法规框架下，乳制品供应链仍存在AFM₁超标的风险，强调了从饲料源头进行防控的极端重要性。研究为使用特定的生物防治真菌（尤其是Trichoderma afroharzianum）作为安全、有效的AFB₁污染控制策略提供了直接证据。同时，它明确了常规酸奶加工无法消除AFM₁，提醒业界需从原料奶质量上严格把关。这些发现为制定更精准的饲料安全标准、推广环境友好的生物防治技术以及完善乳制品全链条风险管理提供了关键的科学依据。