基于石油的微塑料、可生物降解的生物基微塑料与天然对照颗粒对尾鞭毛虫（Paramecium caudatum）的影响，结合原位拉曼光谱检测技术

《Journal of Hazardous Materials》：Effects of petroleum-based and biodegradable bio-based microplastics versus natural control particles on Paramecium caudatum, combined with in situ Raman spectroscopic detection

本研究比较石油基（PB）和生物基（BB）微塑料的纯净及环境处理后的影响，发现BB及部分PB塑料（如PET）可刺激淡水纤毛虫Paramecium caudatum的繁殖率增加，通过μ-Raman光谱证实了微塑料摄入，且环境处理不影响繁殖率。

　　

迈克尔·施瓦泽（Michael Schwarzer）|西蒙娜·蒙德利尼（Simona Mondellini）|维奈·库马尔·班加罗尔-纳拉亚纳（Vinay Kumar Bangalore-Narayana）|西蒙·维兰德（Simon Wieland）|斯文·里查尔（Sven Ritschar）|马文·基内（Marvin Kiene）|朱利安·布雷姆（Julian Brehm）|霍尔格·克雷斯（Holger Kress）|马丁·G.J. 莱德（Martin G.J. L?der）|玛格达莱娜·M. 麦尔（Magdalena M. Mair）|克里斯蒂安·拉福施（Christian Laforsch）

动物生态学I与BayCEER研究组，拜罗伊特大学，德国拜罗伊特95447

摘要

1. 微塑料（MPs）的影响日益令人担忧。尽管许多生态毒理学研究已经探讨了微塑料对生物体的潜在影响，但大多数研究仅测试了有限类型的原始塑料，而这些塑料并不能反映环境条件下塑料的特性。这限制了研究结果在现实世界中的适用范围。此外，要理解微塑料的生态影响，需要从食物网的较低层次开始进行研究。在淡水生态系统中，单细胞纤毛虫是这些营养级的重要组成部分。研究微塑料对纤毛虫的影响对于了解其对整个生态系统的影响至关重要。本研究旨在通过考察微塑料的吸收情况以及环境条件下微塑料对纤毛虫Paramecium caudatum的影响来解决这两个问题。实验中使用了六种基于石油的（PB-）和四种可生物降解的（BB-）微塑料类型，在三种不同浓度下进行暴露实验（尽管这些浓度高于环境中的实际浓度），同时设置了三种颗粒对照组。所有颗粒均在超纯水和淡水环境中培养，以比较原始微塑料与环境条件下微塑料的效果。通过μ-Raman光谱法验证了颗粒的吸收情况，证实了无需使用荧光染料即可实现这一检测。暴露实验结果显示，除了一个处理组外，所有含有BB-微塑料和对照颗粒的处理组中纤毛虫的繁殖率均有所增加；而含有PB-微塑料的处理组结果则不一致。不同颗粒培养条件之间没有观察到显著差异。我们的研究结果表明，微塑料的影响取决于塑料类型，而与环境条件无关；此外，Paramecium caudatum对微塑料的吸收会改变其拉曼光谱特征。

引言

1. 过去二十年来，人们逐渐意识到由微塑料（MPs，1–1000微米，ISO 24187:2023 [1]）引起的环境污染影响了环境的每一个部分以及其中的生物体。因此，微塑料污染的潜在生态毒理学效应受到了更多关注，相关研究也日益增多，这些研究探讨了微塑料对不同物种的影响。最初的研究主要集中在海洋物种上 [2] [3]，但现在也扩展到了其他环境中的生物体，如淡水生态系统和土壤生态系统 [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]。
2. 迄今为止，大多数已发表的研究都集中在原始的基于石油的微塑料（PB-MPs）上，例如聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）和聚氯乙烯（PVC）[11] [12] [13] [14]。因此，由PB-MPs引起的污染持续引发公众的关注。相应地，市场对看似更安全的替代品（如基于生物的和/或可生物降解的塑料，如聚乳酸（PLA）、聚羟基烷酸酯（PHAs）、聚丁酸丁二醇酯（PBS）、聚己内酯（PCL）和淀粉基塑料）的需求也在稳步增长 [16]。随着BB-塑料产量的增加，这些聚合物未来可能会显著加剧塑料垃圾和微塑料污染 [17]。然而，关于BB-MPs影响的研究至今仍较少（例如 [18] [19] [20]），仅有少数研究报道了相关结果（例如 [21] [22]，K?nig Kardgar等人，2024年）。特别是随着BB-塑料产量的增加，迫切需要更多关于PB-MPs和BB-MPs生物效应的比较研究。
3. 目前，大多数关于微塑料影响的研究仅测试了有限种类的PB-塑料，主要是原始颗粒 [19] [23] [24] [25]。然而，一旦微塑料进入环境，其表面会迅速与周围物质发生相互作用。它们会被溶解的有机物、腐殖酸和富里酸、细胞外聚合物（EPS）以及无机物质（如矿物质和离子）形成的复杂基质包裹，从而形成所谓的“生态冠层” [26] [27]。当颗粒足够大时，还可能被微生物群落定殖，形成所谓的“塑料圈” [28]。所有这些因素都可能改变环境条件下微塑料的行为和毒性，并增加生物体和细胞对其的吸收概率 [29] [30] [31]。因此，在实验室中用与环境条件下微塑料性质不同的原始微塑料颗粒来暴露生物体，很可能无法准确反映环境中的实际情况 [32]。这限制了将实验结果推广到现实世界的能力。
4. 关于所研究的生物群，目前实验室中对微塑料影响的实验主要依赖于各种模式物种，如绿藻Acutodesmus obliquus [33]、Chlorella vulgaris [34]，或动物如Daphnia magna [19] [35] [36]、Dreissena polymorpha [37]、Lumbriculus variegatus [38]、Gammarus fossarum [39]、Cyprinus carpio [11] 或 Danio rerio [40]。然而，要理解微塑料的生态影响，需要更多关注食物网较低层次的研究。经常被忽视的一类生物是单细胞淡水纤毛虫 [25] [41] [42] [43]。纤毛虫对水生生态系统至关重要，因为它们是初级生产者与更高营养级之间的关键纽带 [44] [45]。虽然纤毛虫已被用作研究抗生素 [46]、杀虫剂 [44] 和金属 [47] [48] 等物质影响的模式生物，但关于微塑料暴露对这些生物影响的全面研究仍然不足。目前关于微塑料与淡水纤毛虫相互作用的研究较少（例如 [25] [41] [42] [43] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55]，Zang等人，2024年 [56]）。因此，特别是随着BB-塑料产量的增加，迫切需要更多关于PB-MPs和BB-MPs生物效应的比较研究。
5. 迄今为止，大多数关于微塑料影响的研究仅测试了有限种类的PB-塑料，主要是原始颗粒 [19] [23] [24] [25]。然而，一旦微塑料进入环境，其表面会迅速与周围物质发生相互作用。它们会被溶解的有机物、腐殖酸和富里酸、细胞外聚合物（EPS）以及无机物质（如矿物质和离子）形成的复杂基质包裹，从而形成“生态冠层” [26] [27]。当颗粒足够大时，还可能被微生物群落定殖，形成所谓的“塑料圈” [28]。所有这些因素都可能改变环境条件下微塑料的行为和毒性，并增加生物体和细胞对其的吸收概率 [29] [30] [31]。因此，在实验室中用与环境条件下微塑料性质不同的原始微塑料颗粒来暴露生物体，可能无法准确反映环境中的实际情况 [32]。这限制了将实验结果推广到现实世界的能力。
6. 在当前关于微塑料对淡水生物影响的实验室研究中，主要使用了一些模式物种，如绿藻Acutodesmus obliquus [33]、Chlorella vulgaris 或动物如Daphnia magna [19] [35] [36]、Dreissena polymorpha [37]、Lumbriculus variegatus [38]、Gammarus fossarum [39]、Cyprinus carpio [11] 或 Danio rerio [40]。然而，要理解微塑料的生态影响，需要更多关注食物网较低层次的研究。经常被忽视的一类生物是单细胞淡水纤毛虫 [25] [41] [42] [43]。纤毛虫对水生生态系统至关重要，因为它们是初级生产者和更高营养级之间的关键纽带 [44] [45]。虽然纤毛虫已被用作研究抗生素 [46]、杀虫剂 [44] 和金属 [47] [48] 等物质影响的模式生物，但关于微塑料暴露对这些生物影响的全面研究仍然不足。现有的少数研究主要使用原始的PB-MPs颗粒 [25] [41] [42] [43] [49] [50] [51] [52] [53] [54] [55]，Zang等人，2024年 [56]。然而，为了进行现实的风险评估和理解潜在的生态系统级影响，有必要详细分析不同类型的微塑料（包括PB-MPs和BB-MPs），并比较原始颗粒和环境条件下的微塑料。
7. 本研究旨在探讨微塑料对淡水纤毛虫Paramecium caudatum的潜在影响。这些生物体被暴露于各种PB-和BB-微塑料碎片（所有d₅₀约20微米）。为了评估微塑料的环境相关特性，我们将原始微塑料与环境条件下的微塑料的影响进行了比较。为了单独研究颗粒的存在效应，我们在额外的实验中加入了天然（非塑料）对照颗粒（[7] [57]、de [58]），以及纤维素碎片、高岭土（即矿物颗粒）和贻贝壳碎片（MS）。此外，我们的研究还开发了一种先进的μ-Raman光谱方法，能够在不使用荧光标记或固定剂的情况下，在单一实验设置中确认所有PB-MPs、BB-MPs和对照颗粒的吸收情况。
8. 该方法基于之前的研究开发，这些研究能够在组织和细胞中检测到微塑料 [59] [60] [61] [62]。这种方法使我们能够在细胞内识别每种类型的塑料颗粒，从而为未来的研究建立了创建真实剂量-反应曲线的工具。

Paramecium caudatum培养

淡水纤毛虫Paramecium caudatum来源于我们实验室内部建立的培养系，最初从德国柏林的Carolina Science GmbH购买。这些纤毛虫被饲养在500毫升的Erlenmeyer Duran烧瓶（DURAN系列，德国韦特海姆）中，培养基为Z medium [25]，并在超纯水（PURELAB Flex，ELGA LabWater，德国策勒的Veolia Water Technologies公司）中以1:4的比例稀释。培养在黑暗环境中进行，并且可以自由摄取食物。

微塑料表征和生物膜形成

在淡水环境中暴露两周后，我们观察到微塑料颗粒（如PDLLA和PET）和天然对照颗粒（如MS）表面形成了典型的生物膜结构。这些结构在UW培养的颗粒上则不可见（见图1）。这些结构包括无定形形态，可能由淡水中的生物分子和生物残骸组成。此外，颗粒表面还存在各种形状和大小的细胞，可能代表...

讨论

1. 本研究旨在评估原始微塑料（PB-和BB-MPs）和天然对照颗粒对Paramecium caudatum繁殖的潜在影响，并将其与经过环境条件处理后的相同颗粒进行比较。为了确定颗粒的吸收情况及其摄入后的潜在变化，我们使用拉曼光谱法在生物体内识别了微塑料。

结论

1. 本研究证明Paramecium caudatum能够吸收各种类型的微塑料，包括PB-和BB-塑料以及天然对照颗粒。此外，我们的结果显示，在测试前对颗粒进行环境处理并未影响Paramecium caudatum的无性繁殖率。颗粒暴露对繁殖有促进作用，表明本研究中的大多数颗粒类型都刺激了其繁殖。

环境影响

1. 纤毛虫具有广泛的功能多样性，因此是水生食物网的关键组成部分。由于它们以颗粒为食，可能会受到微塑料的影响。本研究比较了基于生物的可生物降解微塑料和基于石油的微塑料（无论是否形成生物膜）对Paramecium caudatum繁殖的影响。结果表明，基于生物的可生物降解微塑料以及PET促进了繁殖。此外，μ-Raman光谱法有助于...

未引用的参考文献

[123], [124], [125], [126], [127], [128], [129], [130], [131], [132], [133], [134]

资助

该项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（项目协议编号860720）以及德国研究基金会（DFG）的资助（项目编号391977956 – SFB 1357）的支持。

CRediT作者贡献声明

斯文·里查尔（Sven Ritschar）：撰写 – 审稿与编辑，数据分析。马文·基内（Marvin Kiene）：撰写 – 审稿与编辑，数据分析，方法学研究，调查，数据整理，可视化。维奈·库马尔·班加罗尔-纳拉亚纳（Vinay Kumar Bangalore-Narayana）：撰写 – 审稿与编辑，验证，方法学研究，调查，数据整理，可视化。西蒙·维兰德（Simon Wieland）：撰写 – 审稿与编辑，可视化，方法学研究，调查。迈克尔·施瓦泽（Michael Schwarzer）：撰写 – 审稿与编辑，初稿撰写，可视化，验证，项目管理，方法学研究。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
感谢Seema Agarwal教授、Daniel Wagner博士和Dipannita Ghosh博士（拜罗伊特大学大分子化学II系）在CRC 1357项目（项目编号Z01）和LimnoPlast（欧盟H2020资助协议编号860720）的合作框架内提供的塑料碎片和尺寸分布测量。同时感谢Mechthild Kredler和Hannah Ganzleben在生物体培养方面的支持。感谢Thomas Scheibel和Hendrik Bargel在扫描方面的协助。