《Advanced Science》：Glucuronolactone Promotes Mucin Sulfation to Alleviate Deoxynivalenol-Induced Intestinal Injury via Microbiota-Dependent and -Independent AHR Activation
编辑推荐：
本研究揭示了葡萄糖醛酸内酯通过促进肠道黏蛋白硫酸化来缓解脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）诱导的肠道损伤的新机制。研究发现，一方面GLU通过增加益生菌解淀粉乳杆菌的丰度和管腔吲哚-3-乙酸（IAA）水平激活芳烃受体（AHR）信号通路，另一方面GLU自身也能直接独立于微生物群激活AHR。激活的AHR转录上调了硫酸基转移酶GAL3ST3的表达，进而驱动了关键的黏蛋白硫酸化过程。这项研究为对抗DON污染的肠道毒性提供了一种有前景的营养干预策略。
1 引言
脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是一种由镰刀菌属产生的普遍存在的单端孢霉烯族霉菌毒素，是全球范围内对人类和牲畜肠道健康的主要威胁。其在小肠的暴露和吸收过程中会诱发严重的肠道损伤和免疫功能障碍。维持肠道杯状细胞稳态是缓解DON诱导的肠道损伤的一个潜在治疗靶点。葡萄糖醛酸内酯是一种来源于葡萄糖的天然代谢物，具有免疫调节特性，但其能否以及如何缓解DON诱导的肠道损伤尚不清楚。
本研究采用多模型方法，包括仔猪和小鼠体内模型、猪肠道类器官和猪肠道上皮细胞系，探究了GLU对DON诱导肠道损伤的保护作用。结合转录组-微生物组-代谢组学分析，揭示了GLU通过微生物依赖和非依赖途径，激活AHR信号通路促进黏蛋白硫酸化，从而维持肠道屏障稳态的保护机制。
2 结果
2.1 GLU减轻DON诱导的肠道损伤和炎症
在仔猪模型中，与CON组相比，DON组仔猪回肠出现了严重的病理变化，包括黏膜下水肿、上皮层损伤和固有层炎性细胞浸润，而补充GLU有效地减轻了这些病理变化。DON挑战提高了血清脂多糖（LPS）和肠道脂肪酸结合蛋白（iFABP）水平，并下调了紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的表达，而GLU显著降低了血清LPS水平，并增强了它们的表达。DON诱导了促炎因子白介素-8（IL-8）的表达并抑制了抗炎因子IL-10的表达，而GLU降低了TNF-α和IL-8的表达并提高了IL-10的表达。这些结果表明GLU可以减轻DON诱导的肠道损伤和炎症。
2.2 GLU通过促进黏蛋白硫酸化来缓解DON诱导的肠道损伤
转录组分析表明，GLU在稳态和DON挑战下均引发了基因表达的显著改变，差异表达基因（DEG）主要富集在与杯状细胞来源的黏蛋白相关的通路中。组织学分析发现，DON降低了回肠绒毛中杯状细胞数量，而GLU处理则提高了其数量。此外，GLU处理还显著提高了杯状细胞标志物MUC2和TFF3的表达。
值得注意的是，在肠道上皮转录组的KEGG通路分析中，GLU诱导的DEGs还富集在与硫相关的通路中，这提示了杯状细胞来源的硫酸化黏蛋白。高碘酸雪夫/阿利新蓝（HID/AB）染色和Maackia Amurensis凝集素II（MALII）染色显示，DON降低了回肠上皮中的硫酸化黏蛋白丰度，而GLU则显著增加了其丰度。相关性分析进一步表明，硫酸化黏蛋白的丰度与回肠上皮损伤评分和炎症评分呈负相关。这些发现表明，GLU可以通过促进黏蛋白硫酸化来缓解DON诱导的肠道损伤。
2.3 GLU相关的肠道微生物群支持黏蛋白硫酸化并减轻DON诱导的肠道损伤
考虑到杯状细胞可以通过分泌黏蛋白调节肠道微生物群，研究调查了GLU和/或DON处理后仔猪回肠微生物群的稳态。结果显示，DON挑战导致回肠中细菌定植显著增加，而补充GLU则减少了细菌定植。主坐标分析表明各组间细菌谱存在显著差异，而α多样性指数无显著差异。线性判别分析效应大小分析发现，益生菌如解淀粉乳杆菌和罗伊氏乳杆菌在GLU处理组中富集。通过回肠微生物群移植实验和共居实验，研究证实了GLU相关的肠道微生物群能够促进黏蛋白硫酸化，并且GLU相关的微生物群可以减轻DON诱导的肠道损伤。
2.4 解淀粉乳杆菌促进IAA产生以支持黏蛋白硫酸化
为了探究GLU相关微生物群中影响黏蛋白硫酸化的潜在代谢物，对仔猪回肠内容物进行了代谢组学分析。分析发现，GLU和/或DON处理导致回肠代谢物谱发生显著改变，差异代谢物在与色氨酸相关的通路中富集。在色氨酸代谢产物中，GLU补充在稳态下显著增加了吲哚和IAA的丰度，在DON挑战下增加了色氨酸和IAA的丰度。研究发现，在共居实验中，GLU处理上调了回肠内容物中的IAA水平，并且将CON小鼠与GLU小鼠共居也提高了CON小鼠的IAA水平。进一步的体内外实验证实，IAA补充能显著提高小鼠回肠和肠道类器官中的硫酸化黏蛋白丰度。
分析发现，DON攻击导致解淀粉乳杆菌丰度有下降趋势，而GLU在稳态和DON条件下均能增加罗伊氏乳杆菌和解淀粉乳杆菌的丰度。值得注意的是，相关性分析显示IAA与解淀粉乳杆菌而非罗伊氏乳杆菌呈显著正相关。体外实验证明，添加色氨酸时，解淀粉乳杆菌显著提高了培养基中的IAA水平。体内实验进一步表明，给抗生素预处理的灌胃解淀粉乳杆菌可提高回肠IAA水平并增加硫酸化黏蛋白丰度。这些发现提示，解淀粉乳杆菌能够促进IAA的产生以支持黏蛋白硫酸化。
2.5 GLU以微生物群非依赖的方式促进黏蛋白硫酸化并减轻DON诱导的肠道损伤
鉴于GLU的免疫调节特性，研究推测GLU本身也可能改善黏蛋白硫酸化和DON诱导的肠道损伤。使用抗生素处理清除肠道微生物群后，尽管管腔IAA水平未因GLU而改变，但GLU给药仍能上调回肠中的硫酸化黏蛋白丰度。此外，在无菌的猪肠道类器官中进行GLU处理的实验也证实，GLU能够促进黏蛋白硫酸化。研究还发现，在没有肠道微生物群的情况下，GLU仍能减轻DON诱导的肠道损伤，改善肠道屏障功能和炎症状态。这些发现表明，GLU可以独立于肠道微生物群而促进黏蛋白硫酸化并减轻DON诱导的肠道损伤。
2.6 GLU通过激活AHR促进黏蛋白硫酸化
研究表明，AHR信号在黏蛋白硫酸化中起重要作用。免疫染色和qPCR分析显示，DON挑战减弱了AHR及其靶基因CYP1A1和CYP1B1的表达，而补充GLU恢复了它们的表达。在GLU相关LA和IAA补充实验中，也观察到AHR信号活性的增强。对DON和/或GLU处理的猪肠道上皮转录组数据重新分析发现，DON降低了AHR、CYP1A1和CYP1B1的基因表达，而GLU处理挽救了AHR和CYP1A1的表达。蛋白质印迹分析也证明GLU在DON挑战后恢复了AHR信号活性。分子对接和分子动力学模拟分析显示，GLU可以作为猪AHR的配体与之结合。
利用AHR敲除小鼠和AHR拮抗剂CH-223191，研究发现GLU无法再提高CYP1A1和CYP1B1的mRNA表达，其促进黏蛋白硫酸化的作用也被消除。在AHR被抑制的情况下，GLU对DON诱导的肠道损伤和炎症的保护作用也消失了。这表明GLU通过激活AHR信号来促进黏蛋白硫酸化。
2.7 GLU通过AHR介导的转录调控增强硫酸基转移酶GAL3ST3的表达
为了探究GLU介导的AHR激活促进黏蛋白硫酸化的分子机制，研究分析了与硫酸化相关的各种酶的基因表达。值得注意的是，GLU处理诱导了许多硫酸化相关酶的表达，而DON挑战抑制了它们的表达。在这些酶中，只有硫酸基转移酶GAL3ST3的表达在稳态和DON挑战下均被GLU上调。蛋白质印迹分析也显示，GLU给药有效地恢复了DON挑战下的GAL3ST3蛋白表达。相关性分析显示，硫酸化黏蛋白丰度与猪回肠中GAL3ST3的相对表达呈正相关。
研究发现，使用AHR拮抗剂CH-223191可以成功抑制体外AHR信号活性，并且GLU对GAL3ST3表达的促进作用被CH-223191逆转，这表明AHR信号对于GLU介导的GAL3ST3表达至关重要。在AHR敲除小鼠中，GAL3ST3mRNA表达显著降低。双荧光素酶报告基因实验和染色质切割与运行定量PCR分析证实，AHR可以直接结合到猪GAL3ST3基因的启动子上，并且GLU给药有效增强了这种结合。利用GAL3ST3敲除小鼠，研究证实GAL3ST3对于GLU介导的黏蛋白硫酸化和肠道保护至关重要。
3 讨论
本研究系统性地探索了GLU通过微生物依赖和非依赖途径减轻DON诱导肠道损伤的机制。一方面，GLU通过增加解淀粉乳杆菌的丰度和管腔IAA水平来激活AHR信号通路；另一方面，GLU本身可以直接独立于微生物群和IAA提高AHR信号活性。GLU对AHR的激活转录促进了硫酸基转移酶GAL3ST3的表达，从而驱动了黏蛋白硫酸化，最终缓解了DON诱导的肠道损伤。本研究结果确定了GLU作为一种有前途的营养干预或治疗剂，以对抗DON污染对肠道健康的危害，并强调了AHR驱动的黏蛋白硫酸化是宿主防御DON诱导肠道损伤的关键机制。
