《CNS Neuroscience & Therapeutics》：Chidamide Is Screened to Suppress Epileptogenesis in Mice Models via Blocking Histone Deacetylase 1
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这篇研究性论文揭示了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂希达胺（Chidamide, Chi）的抗癫痫发生潜力。通过体外筛选及在PTZ和KA诱导的小鼠癫痫模型中进行验证，研究发现Chi能有效降低癫痫易感性，减少自发性复发性癫痫发作（SRS），并通过抑制神经元HDAC1改善神经元存活、抑制苔藓纤维出芽（MFS）和胶质细胞活化。这项研究表明，已获FDA批准的Chi有望作为靶向表观遗传机制的抗癫痫发生药物进行老药新用。
本研究首次为已获FDA批准的组蛋白去乙酰化酶抑制剂希达胺（Chidamide, Chi）在癫痫中的抗癫痫发生作用提供了证据。尽管Chi在多种恶性肿瘤及阿尔茨海默病等神经退行性疾病模型中显示出治疗效益，但其在癫痫发生中的作用此前尚未被探索。
3.1 Chi能够显著改善神经元存活并降低PTZ诱导的急性癫痫模型的癫痫易感性
为寻找具有潜在神经保护作用的HDAC抑制剂，研究者在无Mg2+诱导的PC12细胞模型中筛选了一组已获FDA批准的化合物，其中包括九种HDAC抑制剂。结果显示，与无Mg2+模型相比，Chi处理显著提高了神经元存活率。在急性PTZ诱导癫痫模型中，每隔一天给予5 mg/kg剂量的Chi预处理虽然对癫痫发作潜伏期无显著影响，但导致癫痫发作评分随时间推移而降低。值得注意的是，与每日给药相比，每隔一天给药组在15分钟时间点的癫痫发作评分出现了短暂的显著下降。定量分析进一步表明，Chi以剂量依赖的方式显著降低了癫痫发作频率。此外，Chi预处理还提高了PTZ诱导癫痫发作后动物的存活率，表明其对癫痫诱发死亡具有保护作用。这些结果表明，Chi能有效降低癫痫发作的严重程度。
3.2 Chi在KA诱导的小鼠模型中抑制癫痫发生
由于癫痫发生在癫痫中至关重要，抗癫痫发生治疗可作为一种新的治疗策略。因此，研究者进一步通过分析自发性复发性癫痫发作频率来评估Chi是否能阻断癫痫发生，SRS是癫痫发生的可靠指标。脑电图记录结果表明，KA处理的小鼠表现出频繁且剧烈的SRS，而Chi治疗显著降低了SRS事件的频率和强度。热图分析显示，与KA组相比，Chi治疗组小鼠的SRS数量显著减少。定量分析表明，两个Chi治疗组的累积SRS数量均显著下降，其中每日给药显示出更佳的效果。这些结果表明，Chi通过减少SRS频率和严重程度，有效抑制了癫痫发生过程，每日给药能提供更优的癫痫控制。
3.3 Chi在KA诱导的癫痫发生模型中保护神经元存活、减少苔藓纤维出芽和抑制胶质细胞活化
神经元丢失是癫痫发生过程中的常见现象。研究发现，每日给予5 mg/kg Chi连续14天，显著减轻了癫痫发生过程中CA1区的锥体神经元损伤，在CA3区和齿状回（DG）区域也观察到神经元损伤减少的趋势。对于癫痫发生后一个明确的病理标志——苔藓纤维出芽，Timm染色结果显示，每日给予Chi显著减轻了KA小鼠模型DG区的MFS。此外，神经胶质细胞活化也是癫痫发生过程中一个明确的病理标志。免疫荧光染色结果显示，在KA注射后1个月的海马体中出现了星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生。值得注意的是，每日给予Chi显著抑制了这种现象。这些发现表明，Chi能有效抑制癫痫发生过程中的胶质细胞活化。
3.4 Chi降低KA诱导的癫痫模型中神经元HDAC1的表达
既往证据表明，HDAC1是Chi的重要靶点。为确定Chi是否在癫痫背景下调节HDAC1表达，研究者首先评估了KA诱导的癫痫小鼠海马体中HDAC1的蛋白水平。Western印迹分析显示，KA注射后HDAC1表达显著上调，而每日Chi治疗后其表达显著降低。为进一步表征HDAC1表达的细胞类型特异性，研究者进行了HDAC1与神经元标记物NeuN的双重免疫荧光染色。结果显示，每日给予Chi逆转了KA诱导的海马结构变形，保护了海马完整性。此外，HDAC1免疫反应性主要定位于NeuN阳性神经元。这些发现表明，Chi特异性地下调海马神经元中的HDAC1表达，并保护其免受损伤，这可能有助于其发挥抗癫痫发生作用。
3.5 神经元HDAC1的过表达消除了Chi的抗癫痫发生效应
为研究神经元HDAC1是否影响Chi的抗癫痫发生效应，研究者通过AAV递送在神经元特异性启动子Syn的控制下实现了HDAC1过表达。海马中ZsGreen的自发荧光证实了病毒转导的成功，ZsGreen与NeuN在海马中的共定位表明病毒成功进入神经元。Western印迹分析进一步证实，AAV介导的基因转移后，海马HDAC1蛋白水平显著增加。此外，体内神经元HDAC1过表达加剧了亚惊厥剂量KA处理后小鼠的SRS，而Chi治疗明显逆转了这种现象。这些发现表明，神经元HDAC1过表达加剧了癫痫发生过程中的SRS发生，进一步支持了Chi的抗癫痫发生效应至少部分是通过抑制神经元中的HDAC1介导的。
3.6 神经元HDAC1的过表达消除了Chi对癫痫发生相关致病事件的抑制作用
为评估神经元HDAC1过表达对Chi介导的神经保护作用的影响，研究者首先通过尼氏染色检测了海马神经元的存活情况。与对照组相比，亚惊厥剂量KA处理并未引起显著的神经元丢失，而神经元HDAC1过表达加剧了神经元丢失。Chi治疗显著增加了存活神经元的数量。接下来，在亚惊厥剂量KA组未观察到显著的MFS，而在神经元中过表达HDAC1后发现了显著的MFS，这在Chi治疗后受到显著抑制。此外，研究还评估了神经元HDAC1过表达是否会影响Chi对癫痫发生后胶质细胞活化的抑制作用。研究发现，在神经元HDAC1过表达的亚惊厥剂量KA处理小鼠的海马中出现了明显的星形胶质细胞活化，而Chi治疗后GFAP阳性面积显著减少，表明此现象被明显抑制。同样，亚惊厥剂量KA处理后神经元HDAC1过表达诱导了明显的小胶质细胞活化，Chi治疗显著逆转了这一现象。
4 讨论
在本研究中，研究者首次证明了已获FDA批准、广泛应用于肿瘤学的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Chi在癫痫小鼠模型中发挥抗癫痫发生作用。通过结合对临床可用HDAC抑制剂的系统筛选和体内验证，发现Chi能显著改善神经元存活，减轻化学诱导小鼠模型的癫痫易感性和癫痫发生。这些数据进一步表明，这些效应至少部分是通过选择性抑制神经元中的HDAC1介导的，因为神经元过表达HDAC1明显逆转了Chi的抗癫痫发生效应。这些发现扩展了Chi在肿瘤学以外的治疗潜力，并凸显了其作为癫痫再适应疾病修饰药物的前景。
癫痫易感性是癫痫疾病负担和进展的关键决定因素。在本研究中，Chi显著抑制了PTZ和KA诱导的癫痫模型中的癫痫易感性，表明其抗癫痫作用可以进一步调节癫痫发生过程。癫痫发生通常与遗传性或获得性癫痫的发展有关，并可能持续很长时间。它是一个涉及复杂分子和结构改变的动态过程。关键机制包括神经变性、异常神经发生、胶质增生、异常突触重塑、血脑屏障破坏、炎症细胞募集和离子通道功能障碍。这些改变共同促进了反复自发性癫痫发作和疾病进展。本研究发现，在KA诱导的慢性癫痫模型中，Chi显著抑制了癫痫发生，这反映在癫痫发作发展和进程的减少上。这些结果表明，除了其急性抗癫痫作用外，Chi还可以改变潜在的疾病过程，因此有望成为一种新型的抗癫痫发生疗法。
神经元丢失、胶质细胞活化和异常苔藓纤维出芽被广泛认为是癫痫发生过程的关键病理特征。神经元丢失破坏了抑制性回路，促进了过度兴奋，从而降低了癫痫发作阈值。同时，激活的星形胶质细胞和小胶质细胞通过释放细胞因子、趋化因子和活性氧促进了促炎微环境，进一步加剧了神经元功能障碍和网络不稳定性。此外，异常的苔藓纤维出芽导致齿状回中形成复发性兴奋性突触回路，加强了癫痫网络的同步化和癫痫发作传播。这些结构和细胞变化破坏了正常的网络稳态，促进了兴奋-抑制失衡，并与不良的治疗结果密切相关。因此，能够减轻这些病理过程的干预措施被认为对于实现疾病修饰效果至关重要。在本研究中，Chi治疗显著减轻了KA诱导的癫痫小鼠模型中的神经元丢失、减少了星形胶质细胞和小胶质细胞的活化、并抑制了苔藓纤维出芽。
作为一种特性明确的HDAC抑制剂，Chi已被证明能选择性靶向I类HDAC，从而影响广泛的生物过程。越来越多的证据表明HDAC参与了癫痫的发病机制，HDAC活性失调可改变基因转录、促进神经炎症，并导致适应不良的网络重塑。I类HDAC的表达和活性改变已在人类癫痫海马组织和颞叶癫痫实验模型中有报道。功能上，靶向I类HDAC的HDAC活性药理学抑制已被证明可以延缓癫痫发展、减少癫痫发作的持续性并减轻实验模型中的神经元损伤。在本研究中，通过使用FDA批准的HDAC抑制剂库进行筛选，发现Chi能有效提高无Mg2+诱导的PC12细胞模型的神经元存活率，并选择性抑制KA诱导的癫痫模型中的HDAC1表达，这与其抗癫痫和抗癫痫发生作用相吻合。这些结果表明，HDAC1抑制可能是Chi在癫痫中发挥神经保护和疾病修饰作用的关键机制，并突显了亚型特异性HDAC靶向在实现更高疗效和更少脱靶效应方面的潜力。
本研究存在一些局限性。在临床上，Chi在癌症患者中通常耐受性良好，大多数不良事件为轻度至中度且可逆，尚未报告一致的神经毒性。临床前研究进一步证明Chi可以穿透血脑屏障。然而，在癫痫中的长期给药可能涉及不同的、可能更低的给药方案和持续的表观遗传调控；因此，在临床转化之前，需要进一步的剂量优化和长期安全性评估。有趣的是，Chi表现出阶段依赖性的疗效模式，间歇性给药在早期似乎更有效，而每日给药在后期慢性阶段显示出更大的益处。这种现象可能反映了癫痫发生过程的动态性和时间演变性。尽管本研究证明Chi减轻了癫痫模型中的神经元损伤和神经病理重塑，但这些效应的精确分子通路仍有待阐明。特别是，尚不清楚HDAC1抑制是直接调节神经元丢失、胶质细胞活化和苔藓纤维出芽，还是这些变化发生在更广泛的网络调控之后。此外，Chi在慢性癫痫模型中的长期疗效、持久性和安全性值得系统研究。
5 结论
总之，本研究结果表明，Chi这种重要的HDAC抑制剂改善了涉及癫痫发生的多个方面，包括降低癫痫易感性、减轻神经元丢失、抑制胶质细胞活化和苔藓纤维出芽。它通过抑制神经元HDAC1发挥抗癫痫发生作用，因为在神经元特异性启动子Syn控制下过表达HDAC1明显阻断了Chi的效果。这些证据表明，Chi在未来有望成为一种有前景的抗癫痫发生药物。
