《Journal of Nanobiotechnology》：Engineered Cas9 exosome vesicles as a novel gene editing tool for targeted ASPN editing in osteoarthritis
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本研究报道了一种创新的骨关节炎(OA)基因治疗策略。该研究构建了软骨细胞亲和肽(Cap)修饰的间充质干细胞(MSCs)来源的工程化外泌体，用于递送靶向Asporin(ASPN)基因的CRISPR/Cas9系统(Cap-Exo/ASPN-Cas9)。该平台在体内外均实现了对OA软骨细胞的高效靶向和ASPN基因的精准敲除，显著抑制了铁死亡和细胞衰老，改善了线粒体功能，并最终延缓了OA的病理进展。该工作为OA的精准基因靶向治疗提供了新的思路和实验依据。
背景
骨关节炎(OA)是一种以关节软骨进行性退变、滑膜炎症和软骨下骨改变为特征的慢性退行性关节疾病，是全球范围内致残的主要原因之一。其病理过程涉及机械应力、炎症介质和遗传易感性等多种因素的复杂相互作用，可触发包括铁死亡、线粒体功能障碍、活性氧(ROS)过量产生、促炎细胞因子和基质降解酶过度表达以及衰老相关分泌表型(SASP)因子分泌增加在内的多种病理途径。Asporin(ASPN)是细胞外基质(ECM)富含亮氨酸重复序列蛋白家族的成员，最初在人类软骨组织中发现。研究表明，ASPN通过与转化生长因子-β(TGF-β)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)等生长因子相互作用，形成负向调节软骨形成、增加OA易感性的反馈环。此外，ASPN的表达水平与OA严重程度呈正相关，加速软骨退变并加剧炎症，凸显了其作为OA治疗潜在靶点的重要性。
基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas9，为疾病治疗带来了革命性前景。然而，其体内安全高效的递送仍是重大挑战。病毒载体存在免疫原性等问题，而非病毒纳米载体，尤其是工程化外泌体，因其优异的生物相容性、低免疫原性和组织靶向能力而备受关注。本研究旨在开发一种软骨细胞靶向的工程化外泌体，用于递送靶向ASPN基因的CRISPR/Cas9系统，以实现对OA的精准基因治疗。
ASPN是OA病理进展中的关键生物标志物
通过对GEO数据库(GSE114007, GSE169077, GSE207881)的生物信息学分析，研究者筛选出OA相关的差异表达基因(DEGs)。维恩图分析显示，在三个数据集中共同上调的DEGs有20个，其中ASPN是OA组与正常组之间表达差异最显著的基因，在OA软骨中显著上调。对不同程度OA小鼠模型的组织学分析也证实，随着OA严重程度增加，关节面粗糙、软骨侵蚀加剧，OARSI评分升高，同时ASPN的阳性表达也随之增强。蛋白质印迹(WB)分析进一步显示，从不同严重程度OA模型分离的软骨细胞中，ASPN蛋白表达水平呈进行性上升，且与OA严重程度呈强正相关。这些结果共同证实了ASPN在OA发病机制中的关键作用，是疾病进展的潜在指标。
软骨细胞靶向工程化外泌体的制备与表征
鉴于ASPN在OA中的重要作用，研究者构建了靶向ASPN基因的CRISPR-Cas9基因编辑平台(ASPN-Cas9)。为了实现对OA软骨细胞的靶向递送，研究者将软骨细胞亲和肽(Cap)与溶酶体相关膜蛋白2b(Lamp2b)融合，对间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体进行表面修饰，得到Cap-Exo。随后，通过优化电穿孔法将ASPN-Cas9质粒装载到Cap-Exo中，形成Cap-Exo/ASPN-Cas9复合物。
透射电子显微镜(TEM)显示，Cap-Exo/ASPN-Cas9呈直径约80-100纳米的卵圆形囊泡。WB证实其表达外泌体标志蛋白TSG101、CD63、CD81，且Cap成功修饰于表面。纳米流式细胞术分析显示其平均粒径为79.89纳米，浓度约1.32×1010particles/mL。由于Cap带正电荷，其Zeta电位为+1.7 mV，更利于与带负电的软骨结合。流式细胞术定量显示，当使用4微克质粒/孔(6孔板)时，Cap的表面修饰效率约为79.1%。使用PicoGreen荧光法测定质粒装载效率，结果显示ASPN-Cas9质粒装载入外泌体的效率为9.5% ± 0.6%。细胞摄取实验显示，用PKH67标记的Cap-Exo/ASPN-Cas9在软骨细胞中显示出比未修饰外泌体显著更高的荧光信号强度，表明其靶向摄取效率更高。体内小动物荧光成像实验也证实，经DiR标记的Cap-Exo/ASPN-Cas9在关节内注射后，在膝关节区域的荧光强度和保留时间均显著长于非靶向组。
Cap-Exo/ASPN-Cas9在体外增强抗炎作用并维持软骨细胞微环境
为评估Cap-Exo/ASPN-Cas9的抗炎效果，研究者检测了其对巨噬细胞极化和炎症因子表达的影响。流式细胞术显示，脂多糖(LPS)/干扰素-γ(IFN-γ)诱导后，M1型巨噬细胞比例显著增加至73.24%，而Cap-Exo/ASPN-Cas9处理可将其比例降至49.36%，与Exo/ASPN-Cas9效果相当，表明敲除ASPN可有效抑制M1型巨噬细胞极化。酶联免疫吸附试验(ELISA)显示，Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效抑制软骨细胞上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、前列腺素E2(PGE2)、白介素-18(IL-18)和亚硝酸盐的水平。WB和免疫荧光(IF)分析进一步证实，Cap-Exo/ASPN-Cas9可显著降低由叔丁基过氧化氢(TBHP)诱导的炎症蛋白[诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX2)、TNF-α]的高表达。
细胞外基质(ECM)降解是OA的核心特征。WB分析表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9处理可显著降低ECM降解关键酶[解整合素样金属蛋白酶4(ADAMTS4)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)]的表达，同时恢复聚蛋白聚糖(Aggrecan)和II型胶原(Collagen-II)的水平。qPCR结果与之一致。甲苯胺蓝(TB)和番红O(SO)染色显示，Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效对抗TBHP诱导的ECM降解。IF分析也表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9能显著恢复TBHP降低的Collagen-II荧光强度，并降低TBHP升高的MMP-13荧光强度。这些结果表明Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效抑制ECM降解，维持软骨细胞微环境稳态。
CRISPR-Cas9介导的ASPN敲除可能通过与Nrf2转录因子相互作用发挥效应
为探究ASPN敲除的分子机制，研究者对Cap-Exo/ASPN-Cas9处理的软骨细胞进行了转录组测序。与对照组相比，共鉴定出2265个DEGs，其中上调1075个，下调1190个。有趣的是，核因子E2相关因子2(NFE2L2，即Nrf2)基因是上调基因之一。分子对接分析显示，ASPN与Nrf2可通过8个氢键紧密结合。免疫共沉淀(Co-IP)实验进一步在体外证实了ASPN与Nrf2之间存在相互作用。
WB实验发现，在正常和OA条件下，敲低ASPN并不影响Nrf2的总蛋白表达量。然而，核质分离实验显示，在正常和TBHP条件下，敲低ASPN后，细胞核内Nrf2的量增加，而细胞质内Nrf2的量减少，这表明ASPN在细胞质中与Nrf2结合，减少了Nrf2进入细胞核。抗氧化反应元件(ARE)荧光素酶报告基因检测也证实，沉默ASPN可显著增强ARE荧光素酶活性，即增强了Nrf2的转录活性。这些结果表明，ASPN通过与Nrf2结合，限制了其核转位和转录活性。
进一步的基因集富集分析(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)和基因集富集分析(GSEA)表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9处理显著富集于与ECM组织、软骨发育相关的通路，而与细胞衰老、铁死亡相关的通路则显著下调。这提示，ASPN敲除后减少Nrf2降解，可能通过抑制铁死亡和细胞衰老来发挥其保护效应。
Cap-Exo/ASPN-Cas9在体外抑制软骨细胞铁死亡并缓解细胞衰老
铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式。研究表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9处理能有效降低TBHP诱导的软骨细胞内ROS水平、Fe2+积累和脂质过氧化，其效果与铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)相当。WB分析显示，在OA模型中，TBHP处理导致铁死亡负调控蛋白[溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白重链1(FTH1)]表达下降，而正调控蛋白酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)表达上升。Cap-Exo/ASPN-Cas9处理可显著逆转这些蛋白的表达变化。IF成像也证实，Cap-Exo/ASPN-Cas9能恢复TBHP降低的SLC7A11和GPX4荧光强度。
细胞衰老是OA的另一个重要特征。WB分析显示，TBHP处理显著增加了衰老相关蛋白(P53、P21、P16)的表达，而Cap-Exo/ASPN-Cas9处理可显著抑制这种诱导。qPCR结果与之吻合。衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色显示，TBHP处理显著增加了SA-β-Gal阳性细胞比例，而Cap-Exo/ASPN-Cas9处理则大幅降低了该比例。这些结果表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9能有效抑制软骨细胞的铁死亡和细胞衰老。
Cap-Exo/ASPN-Cas9通过激活Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡从而缓解线粒体功能障碍
Nrf2/HO-1通路是细胞抗氧化防御的核心。WB分析显示，TBHP诱导的ROS升高显著降低了细胞核内Nrf2(n-Nrf2)的水平，而Cap-Exo/ASPN-Cas9处理有效恢复了n-Nrf2的表达，并上调了下游抗氧化蛋白[血红素加氧酶1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)]。IF分析显示Cap-Exo/ASPN-Cas9处理后Nrf2在细胞核内明显积累。ARE荧光素酶报告基因实验再次证实Cap-Exo/ASPN-Cas9可增强Nrf2转录活性。使用Nrf2特异性抑制剂ML385处理，可部分逆转Cap-Exo/ASPN-Cas9对铁死亡标志物GPX4和SLC7A11的调控作用，表明其效应依赖于Nrf2通路。
线粒体功能障碍与铁死亡密切相关。TEM观察发现，TBHP处理导致线粒体明显肿胀、膜结构受损，而Cap-Exo/ASPN-Cas9处理极大地缓解了这些异常。WB分析显示，Cap-Exo/ASPN-Cas9处理可上调线粒体融合相关蛋白[视神经萎缩蛋白1(OPA1)、线粒体融合蛋白1(MFN1)、线粒体融合蛋白2(MFN2)]的表达，下调线粒体分裂相关蛋白[动力相关蛋白1(DRP1)]的表达。线粒体超氧化物指示剂MitoSox染色显示，Cap-Exo/ASPN-Cas9可显著降低TBHP诱导的线粒体ROS生成。MitoTracker Red染色表明Cap-Exo/ASPN-Cas9恢复了受损的线粒体活性。JC-1染色评估线粒体膜电位(ΔΨm)显示，TBHP处理显著降低了线粒体膜电位，而Cap-Exo/ASPN-Cas9处理可使其恢复至接近基线水平。综上所述，ASPN敲除通过激活Nrf2/HO-1通路，抑制软骨细胞铁死亡，缓解线粒体功能障碍，从而减少炎症、ECM降解和细胞衰老。
CRISPR-Cas9介导的ASPN敲除在体内缓解小鼠骨关节炎
为评估体内疗效，研究者建立了内侧半月板失稳(DMM)手术诱导的OA小鼠模型。术后每周进行关节腔内注射治疗，持续四周。X射线和微型计算机断层扫描(Micro-CT)评估显示，DMM组关节出现明显的骨赘形成、软骨下骨硬化、小梁异常和关节间隙狭窄。Cap-Exo/ASPN-Cas9治疗产生了最显著的保护效果，能明显减少骨赘、平滑关节面、增加小梁密度、扩大关节间隙，其效果接近FDA批准的OA药物塞来昔布。
番红O/固绿、甲苯胺蓝和苏木精-伊红(H&E)染色显示，DMM组软骨显著磨损、厚度变薄，OARSI评分高达5.67分，滑膜炎评分也最高。Cap-Exo/ASPN-Cas9治疗可显著拮抗软骨降解，促进软骨厚度恢复，将OARSI评分降至1.33分，并将滑膜炎评分显著降低。免疫组织化学(IHC)分析进一步验证了Cap-Exo/ASPN-Cas9在OA小鼠模型中的作用。DMM手术显著减少了Nrf2阳性区域，增加了铁死亡标志物ACSL4、MMP-13的表达，降低了II型胶原水平，并增加了炎症标志物iNOS和COX2的表达。Cap-Exo/ASPN-Cas9治疗显著逆转了这些病理变化。关节软骨组织IF染色显示，DMM模型中GPX4荧光强度大幅降低(对照组的0.23倍)，表明铁死亡增强；Cap-Exo/ASPN-Cas9处理将GPX4水平恢复至约对照组的0.79倍。同时，Cap-Exo/ASPN-Cas9还能显著降低滑膜中CD68(巨噬细胞标志物)的表达，并减少软骨中DRP1的表达，表明其在体内也能缓解线粒体功能障碍。此外，衰老标志物P16的表达在DMM组显著升高(2.19倍)，而Cap-Exo/ASPN-Cas9干预显著降低了P16表达水平，缓解了软骨细胞衰老。主要器官的组织病理学检查未发现Cap-Exo/ASPN-Cas9给药引起的可检测到的全身毒性。
讨论
本研究发现ASPN是连接氧化还原失衡、铁死亡、线粒体功能障碍和软骨细胞衰老的关键上游调节因子。机制上，ASPN直接与细胞质中的Nrf2相互作用，限制其核转位和转录活性，从而抑制Nrf2介导的抗氧化信号，使软骨细胞更容易受到氧化应激的损害。ASPN敲除显著减少了ASPN-Nrf2结合，恢复了Nrf2核积累，增强了抗氧化反应。Nrf2活性抑制的下游后果之一是促进了铁死亡。本研究中，通过Cap-Exo/ASPN-Cas9敲除ASPN，可显著减轻脂质过氧化和铁过载，通过重新激活Nrf2/HO-1抗氧化轴来抑制铁死亡。线粒体功能障碍是氧化应激和铁死亡之间的关键交汇点。Cap-Exo/ASPN-Cas9治疗可 substantially 恢复线粒体完整性，并重新平衡线粒体动力学。持续的氧化应激、铁死亡和线粒体功能障碍共同驱动软骨细胞衰老。Cap-Exo/ASPN-Cas9治疗显著减少了SA-β-Gal阳性细胞，并下调了p16和p21的表达。这些抗衰老效应与铁死亡应激减少和线粒体功能恢复相吻合。
本研究也存在一些局限性。首先，外泌体递送策略的装载效率和稳定性仍需进一步优化。其次，尽管外泌体提高了递送特异性，但软骨穿透有限、滑膜清除、在深层软骨区保留不足等挑战仍未解决。未来的工程策略可能需要同时实现组织和细胞特异性靶向。再者，ASPN与Nrf2相互作用的具体分子机制尚未完全阐明，需要未来在机制研究中进一步验证。最后，虽然体内外实验证实了Cap-Exo/ASPN-Cas9的短期安全性和生物相容性，但仍需更全面的评估。
结论
本研究表明，Cap-Exo/ASPN-Cas9在体内外对OA均具有显著的保护作用。ASPN敲除有效减少了Nrf2降解，激活了Nrf2/HO-1通路，并抑制了软骨细胞的铁死亡。此外，Cap-Exo/ASPN-Cas9治疗缓解了线粒体功能障碍，减轻了炎症，维持了软骨细胞微环境稳态，减少了细胞衰老，从而延缓了OA进展。因此，靶向CRISPR-Cas9介导的ASPN缺失代表了一种新颖且有前景的OA治疗方法，为未来的治疗策略奠定了基础。
