《Mycopathologia》：The Biosynthetic Gene Cluster of Boydines in Scedosporium apiospermum
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【编辑推荐】Scedosporium菌种是免疫功能低下患者的致命威胁，其致病机制尚不明确。为解决此问题，研究人员针对先前被认为负责合成aspirochlorine的生物合成基因簇（BGC）展开了大规模基因组学与生物信息学研究。结果确认，该BGC实际编码合成一类与aranotin相关的杂合化合物——boydines。此基因簇包含15个基因，其中包括一个聚酮合酶（PKS）基因，负责合成附着在二肽骨架上的聚酮链。同线性分析表明，该BGC及其产物广泛存在于多种Sordariomycetes甚至一些系统发育较远的霉菌中，并可能在真菌逃避宿主氧化应激反应中扮演角色。此项研究揭示了Scedosporium致病菌次级代谢产物的关键合成途径，为开发新型抗真菌靶点提供了重要线索。
在真菌感染的战场上，Scedosporium属的丝状真菌是让医生们头疼的“狡猾”敌人。它们能在免疫功能低下的患者，特别是囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）患者的呼吸道中“安营扎寨”，引发从皮下感染到侵袭性肺炎等一系列严重问题，有时甚至危及生命。尽管威胁巨大，但科学家们对它们的致病“武器库”——也就是其致病机制——的了解却相当有限。这就像一个我们知道强盗很危险，却不知道他具体用什么武器作案一样，给预防和治疗带来了巨大挑战。
这些真菌在环境中和宿主体内生存并非易事。它们需要对抗周围的细菌和其他真菌的竞争，还需要在铁元素稀缺的环境中“抢铁”吃，更重要的是，必须设法抵御宿主免疫细胞释放的、具有强大杀伤力的活性氧（也就是氧化应激）的攻击。为了应对这些挑战，真菌进化出了一套精密的“化学工厂”——次级代谢系统，能够生产各种具有特殊功能的小分子化合物。这些化合物有的能抢夺铁（铁载体），有的能抗菌，有的则可能帮助真菌“麻痹”或“欺骗”宿主的免疫系统。由于人类细胞没有类似的合成系统，这些化合物及其合成途径，成为了极具潜力的抗真菌药物新靶点。
在Scedosporium apiospermum中，有两个基因编码的硫氧还蛋白还原酶（Thioredoxin Reductases, TrxRs）被认为在保护真菌抵抗氧化应激中扮演重要角色。有趣的是，这两个基因恰好位于两个生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters, BGCs）中，这些BGCs负责合成非核糖体肽（Non-ribosomal Peptides, NRPs）。先前，其中一个包含TrxR编码基因SAPIO_CDS1830的BGC，因其核心的非核糖体肽合成酶（NRPS）编码基因SAPIO_CDS1828，被生物信息学工具（antiSMASH）预测负责合成一种名为aspirochlorine的表皮二硫代二氧哌嗪（Epidithiodioxopiperazine, ETP）类化合物。然而，化学研究在Scedosporium属中实际鉴定出的却是另一类与ETP aranotin相关的化合物，名为boydines。这种生物信息学预测与化学实验结果之间的“矛盾”，使得这个BGC究竟合成何种产物成了一个悬而未决的谜题。
为了解开这个谜团，来自法国的研究团队在《Mycopathologia》上发表了一项深入研究。他们没有局限于单一菌株，而是将视野扩展至近300个真菌基因组，开展了一次大规模的“基因组寻宝”行动，旨在精确鉴定这个神秘BGC的真实产物及其在真菌界的分布情况。
主要技术方法
研究人员综合运用了多种生物信息学与分子生物学技术。首先，他们进行了大规模的基因组挖掘，利用antiSMASH工具分析了近300个真菌基因组，筛选出具有单个腺苷化结构域和两个缩合结构域的非核糖体肽合成酶（NRPS）。接着，通过PARAS算法进一步确认了腺苷化结构域的底物特异性。为了理清基因簇的成员与功能，他们进行了详尽的系统发育分析和同线性（synteny）分析，比较了S. apiospermum与已知合成acetylaranotin的Aspergillus terreus及合成aspirochlorine的Aspergillus oryzae的对应基因簇。此外，研究还通过聚合酶链式反应（PCR）和测序，验证并连接了部分基因组组装中不连续的片段，以完整重构基因簇。最后，利用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术，评估了该BGC中多个基因在氧化应激条件下的表达水平变化。
研究结果
1. NRPS KEZ45505编码基因SAPIO_CDS1828负责合成环(苯丙氨酸-苯丙氨酸)
通过对大量真菌NRPS的腺苷化结构域进行系统发育分析，研究人员将这些酶分成了三大类。目标蛋白KEZ45505属于第三类，这类NRPS几乎都被预测识别苯丙氨酸，并参与合成环(苯丙氨酸-苯丙氨酸)的衍生物。这为确定其产物是boydines而非aspirochlorine提供了第一个关键证据，因为两者最初的合成步骤都是组装两个苯丙氨酸分子。
2. “Aspirochlorine”生物合成基因簇实际包含15个基因
先前antiSMASH预测该簇有9个基因，但通过更全面的BLAST搜索和功能注释，研究团队发现它实际上由15个基因组成。这个扩展后的BGC包含一个核心NRPS编码基因、十个负责修饰的基因（其中包括一个TrxR编码基因、两个细胞色素P450编码基因以及一个聚酮合酶编码基因）、一个编码Gal4型转录因子的基因以及一个编码主要易化子超家族（Major Facilitator Superfamily, MFS）外排蛋白的基因。特别值得注意的是其中的聚酮合酶（PKS）KEZ45498，其结构域构型为KS-AT-DH-cMT-ER-KR-PP。对其酰基载体蛋白（PP）结构域的分析表明，它可能负责组装三个丙二酰-CoA单元，这与boydines分子中[2R,3S,4S,E]-3-羟基-2,4,6-三甲基-5-氧代辛-6-烯酸的烷基链长度相符。对其烯酰还原酶（ER）结构域的序列分析则发现，其底物或辅因子识别相关的一些关键氨基酸发生了突变，暗示这个ER结构域可能没有功能，这也与boydines烷基链中保留了一个碳碳双键的结构特征一致。
3. 该生物合成基因簇负责合成boydines
将S. apiospermum的该BGC与A. terreus的acetylaranotin BGC及A. oryzae的aspirochlorine BGC进行详细比对后，研究人员发现，S. apiospermum的簇中只有一个具有经典CxxC基序的TrxR编码基因，而aspirochlorine的合成需要两个TrxR（第二个具有CxxH/Q基序以催化二硫键迁移和螺环化）。此外，S. apiospermum缺乏aspirochlorine合成途径后期所需的多个额外细胞色素P450编码基因、卤化酶编码基因等。相反，其BGC中独有的PKS编码基因恰好对应boydines分子中独特的聚酮侧链。所有这些证据一致表明，这个BGC并非合成aspirochlorine，而是负责合成aranotin相关的杂合化合物——boydines。研究还提出了boydines可能的生物合成途径。
4. Boydines生物合成基因簇在所有可用的Scedosporium基因组中共享
该研究在所有已测序的S. apiospermum菌株以及其他Scedosporium属物种（如S. aurantiacum, S. boydii, S. dehoogii, S. minutisporum）的基因组中，都发现了boydines BGC所有成员的直系同源基因。基因的共线性在大多数物种中得到严格保守，仅在S. dehoogii和S. minutisporum中观察到染色体重排。值得注意的是，在原有的Scedosporium prolificans（现更名为Lomentospora prolificans）基因组中未能找到类似的BGC。
5. Boydines生物合成基因簇并非Scedosporium属所特有
同线性分析和BLAST搜索揭示，boydines BGC也存在于其他一些子囊菌门（Sordariomycetes）真菌中，例如Colletotrichum caudatum、Immersiella caudata、Thyridium curvatum，甚至一些系统发育较远的霉菌如Ramularia collo-cygni和某些Zymoseptoria物种中。这表明boydines或其类似物的合成能力在真菌中可能是通过水平基因转移获得，并非Scedosporium属的独有特征。
6. Boydines生物合成基因簇中的基因受协同调控
对S. apiospermum在模拟CF患者痰液环境的合成培养基中，或在高碳酸血症条件下的转录组数据分析显示，该BGC中部分基因的表达下调。然而，当真菌暴露于化学诱导的氧化应激（如用menadione或cumene hydroperoxide处理）时，该BGC中多个被测基因的表达量显著上调。这表明boydines的合成可能与真菌应对宿主氧化杀伤的防御机制有关。
研究结论与意义
本研究通过大规模的比较基因组学、系统发育学和同线性分析，成功地澄清了长期以来关于S. apiospermum中一个关键BGC产物归属的争议。研究证实，该基因簇并非如生物信息学工具所预测的负责合成aspirochlorine，而是编码合成一类与aranotin相关的、带有聚酮侧链的杂合ETP化合物——boydines。这个由15个基因组成的BGC，包含负责起始二肽合成的NRPS、负责聚酮侧链装配的PKS、负责引入二硫键的TrxR以及其他多种修饰酶、调控因子和外排泵，构成了一条完整的boydines合成、调控与转运通路。
该研究的发现具有多重重要意义：首先，它精准解析了一种人类病原真菌潜在毒力因子的生物合成蓝图，将化学上已知的代谢产物（boydines）与其遗传基础直接关联起来，为后续通过基因敲除等手段研究其生物学功能奠定了基础。其次，研究发现boydines BGC广泛存在于Scedosporium属的不同致病种中，提示其产物可能在感染过程中具有保守且重要的功能，尤其是在响应氧化应激方面，这可能与其协助真菌逃避宿主免疫攻击的致病机制相关。再者，该BGC在亲缘关系较远的不同生态位真菌（如植物病原菌、内生菌、腐生菌）中的存在，暗示了次级代谢基因簇在真菌界可能存在复杂的水平转移和进化历程，为研究真菌代谢产物的进化与生态适应提供了新视角。最后，对boydines这类结构独特的杂合ETP化合物生物合成途径的阐明，也为未来开发基于其结构的新型抗菌或免疫调节剂提供了分子靶点和生物合成工程的可能性。
