《Chinese Medicine》：Shuxuening injection improves ventricular remodeling after myocardial infarction by indirectly promoting macrophage-mediated angiogenesis and lymphangiogenesis
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本研究首次阐明舒血宁注射液(SXNI)通过激活巨噬细胞分泌VEGF-A和VEGF-C，间接激活内皮细胞VEGFR2/VEGFR3通路，促进血管与淋巴管新生，从而减轻心肌水肿、炎症与纤维化，改善心肌梗死后心室重构。该研究从“间接药理学”视角揭示了SXNI的多靶点、多通路作用机制，为其临床应用提供了新的理论依据。
背景与目的
心肌梗死(MI)是由于冠状动脉阻塞导致心肌缺血坏死，进而引发心室重构、心功能下降的重大心血管疾病。尽管再灌注治疗如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)和冠状动脉旁路移植术(CABG)可恢复血流，但再灌注损伤以及部分患者不适宜此类治疗，使得寻找新的治疗策略尤为迫切。血管新生和淋巴管新生在MI后修复中至关重要，前者可恢复缺血区血液灌注，后者则有助于引流组织液、减轻水肿和炎症。舒血宁注射液(SXNI)是临床上常用于治疗心血管疾病的中药注射剂，但其改善MI后心室重构的具体机制尚未明确。本研究旨在探讨SXNI对MI后心室重构的影响，并阐明其作用机制，特别是从巨噬细胞介导的间接调节角度入手。
研究方法
研究采用大鼠MI模型（结扎左前降支冠状动脉），将大鼠分为假手术组、模型组、SXNI低剂量组(1.05 mL/kg/d)、临床等效剂量组(2.1 mL/kg/d)、高剂量组(4.2 mL/kg/d)以及阳性药卡托普利组。治疗持续4周。药效学评估包括心脏超声检测心功能（左心室射血分数LVEF、左心室短轴缩短率LVFS等）、测量梗死面积、Masson染色评估纤维化、TUNEL染色检测细胞凋亡。通过免疫组化染色CD31和LYVE-1分别评估血管新生和淋巴管新生，使用Western blot、qRT-PCR和ELISA检测VEGF-A、VEGF-C及其受体VEGFR2、VEGFR3的表达与活化，以及下游信号分子p-AKT、p-ERK的水平。体外实验使用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、小鼠淋巴内皮细胞(SVEC4-10)和巨噬细胞(Raw264.7)。通过CCK-8、划痕实验和管形成实验，分别检测SXNI对细胞活力、迁移和成管能力的直接作用，以及经SXNI处理的巨噬细胞条件培养基对HUVEC和SVEC4-10细胞的间接影响。采用超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱(UPLC-QE-MS)鉴定SXNI的化学成分，并通过分子对接筛选能与VEGF-A/VEGF-C蛋白结合的关键成分，最后通过细胞实验验证这些成分对巨噬细胞分泌VEGF-A和VEGF-C的调节作用。
研究结果
1. SXNI改善MI大鼠心功能并抑制心室重构
与模型组相比，SXNI临床等效剂量(2.1 mL/kg)和高剂量(4.2 mL/kg)治疗能显著提高LVEF和LVFS，降低左心室收缩末期内径(LVID s)和舒张末期内径(LVID d)，减轻心脏肥大指标(心重/体重比)，缩小心肌梗死面积，减少心肌胶原沉积和纤维化区域，并降低血清脑钠肽(BNP)水平。此外，SXNI还能显著抑制心肌细胞凋亡，下调促凋亡蛋白BAX和cleaved-caspase-3的表达，上调抗凋亡蛋白BCL-2的表达。
2. SXNI促进血管与淋巴管新生，减轻心肌水肿和炎症
SXNI治疗显著增加了心肌梗死边缘区CD31+微血管密度和LYVE-1+淋巴管密度。同时，SXNI降低了心脏组织含水量，并降低了血清中促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6的水平。这表明SXNI通过促进血管新生和淋巴管新生，改善了心肌灌注并减轻了水肿和炎症反应。
3. SXNI激活VEGF-A/VEGFR2和VEGF-C/VEGFR3信号通路
在体内，SXNI处理增加了心肌组织和血清中VEGF-A和VEGF-C的蛋白水平。Western blot分析显示，SXNI上调了心脏组织中VEGF-A、p-VEGFR2、VEGF-C和VEGFR3的蛋白表达，并激活了下游的p-AKT和p-ERK信号。
4. SXNI的促血管/淋巴管新生作用通过巨噬细胞间接介导
体外实验发现，SXNI直接处理对HUVEC和SVEC4-10细胞的增殖、迁移和管形成能力无显著影响。然而，SXNI能剂量依赖性地促进Raw264.7巨噬细胞中Vegf-a和Vegf-c的mRNA表达以及VEGF-A和VEGF-C蛋白的分泌。用SXNI处理过的巨噬细胞条件培养基培养HUVEC和SVEC4-10细胞，则能显著促进后者的增殖、迁移和管形成能力。进一步的机制研究表明，该条件培养基能激活HUVEC细胞中的p-VEGFR2、p-AKT和p-ERK信号，以及SVEC4-10细胞中的VEGFR3、p-AKT和p-ERK信号。这证实了SXNI是通过激活巨噬细胞，使其分泌VEGFs，进而间接作用于内皮细胞并激活相关信号通路。
5. 鉴定SXNI中激活巨噬细胞的关键活性成分
通过UPLC-QE-MS从SXNI中鉴定出70种化学成分。分子对接分析发现，银杏内酯A (ginkgolide A)、银杏内酯B (ginkgolide B)、芦丁 (rutin) 和槲皮素3-新橙皮糖苷 (quercetin 3-neohesperidoside) 与VEGF-A和VEGF-C蛋白具有较强的结合潜力。细胞实验证实，这四种化合物均能不同程度地上调Raw264.7细胞中Vegf-a和Vegf-c的mRNA表达，并促进VEGF-A和VEGF-C蛋白的分泌，其中银杏内酯A和银杏内酯B的作用尤为显著。
结论
本研究揭示，舒血宁注射液并非直接作用于血管或淋巴管内皮细胞，而是通过激活巨噬细胞，促进其分泌VEGF-A和VEGF-C等细胞因子，进而间接激活内皮细胞中的VEGFR2/AKT/ERK和VEGFR3/AKT/ERK信号通路，双管齐下地促进血管新生和淋巴管新生。这一过程有助于恢复心肌灌注、减轻组织水肿和炎症、抑制纤维化和细胞凋亡，最终改善MI后的心室重构和心脏功能。银杏内酯A、银杏内酯B、芦丁和槲皮素3-新橙皮糖苷被认为是SXNI中实现上述巨噬细胞激活作用的关键活性成分。该工作从“间接药理学”和免疫调节的新视角，阐明了SXNI治疗MI的多成分、多靶点、多通路作用机制，为其临床应用提供了重要的实验依据和理论支撑。
