致力于开发基于CRISPR-Cas9的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）“杀伤开关”

《Microbial Cell Factories》：Towards the development of a CRISPR-Cas9 based kill switch for Saccharomyces cerevisiae

CRISPR基酵母基因致死开关研究成功但存在切割逃逸问题，通过双gRNA表达优化系统稳定性。

　　

摘要

背景

合成遗传电路的进步使得能够对微生物细胞的生长进行可编程和条件依赖的控制。基于CRISPR-Cas9的“杀灭开关”（即能够根据特定条件使细胞失去生存能力的遗传系统）最近已经在细菌细胞工厂中得到验证，但尚未在酵母中实现。

结果

在这项研究中，我们展示了基于CRISPR的“杀灭开关”（CRISPR KiSS）在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中的基础应用。CRISPR KiSS利用可诱导的CRISPR技术靶向关键基因来抑制细胞生长。该系统的激活是通过在无水四环素（ATc）的作用下条件性表达引导RNA（gRNA）来实现的，从而激活CRISPR介导的基因破坏作用。我们发现，当靶向关键基因（ERG13、PGA3、TPI1或CDC19）时，在ATc的作用下细胞生长会受到严重抑制。然而，目前的系统设置仍无法完全杀死细胞，因为存在系统失活的情况，例如细胞能够逃避CRISPR的切割作用。我们研究了系统失活的原因，并通过同时表达两种不同的gRNA显著改进了该系统。对逃逸突变体的测序显示，gRNA序列和目标基因中都存在可能导致系统失活的突变。

结论

这项工作突显了在酿酒酵母中利用基于CRISPR的“杀灭开关”的潜力。表达该系统的细胞能够通过突变逃避生长抑制，因此仍需进一步优化CRISPR KiSS系统，以便将其应用于各种细胞工厂中。