通过改造台湾假单胞菌（Pseudomonas taiwanensis VLB120），使其能够利用Weimberg途径实现L-赖氨酸的区域性和立体特异性羟基化

《Microbial Cell Factories》：Engineering Pseudomonas taiwanensis VLB120 for regio- and stereospecific hydroxylation of l -lysine fueled by the Weimberg pathway

羟基-l-赖氨酸生物合成；KDO酶催化；韦明格代谢途径；假单胞菌工程；底物效率优化

　　

摘要

背景

羟基-L-赖氨酸是一种多功能的手性构建块，可以通过L-赖氨酸的羟基化反应获得。这一转化过程由α-酮戊二酸依赖性的赖氨酸双加氧酶（KDOs）催化，这类酶属于Fe²⁺/α-酮戊二酸依赖性氧化酶超家族。这些酶具有高度的区域选择性和立体选择性；然而，它们需要α-酮戊二酸（α-KG）作为辅底物。除了直接添加昂贵的α-KG外，还可以通过细胞代谢从廉价且可再生的碳源（如D-木糖）中生成α-KG。因此，我们改造了Pseudomonas taiwanensis VLB120菌株，使其能够利用KDOs高效地将L-赖氨酸转化为羟基-L-赖氨酸，并通过Weimberg途径以D-木糖作为唯一的碳源来供应α-KG。

结果

为了制备合适的整体细胞生物催化剂，我们研究了P. taiwanensis VLB120菌株对L-赖氨酸的代谢途径，并创建了一种缺乏L-赖氨酸代谢能力的突变菌株，以减少L-赖氨酸的降解并促进生物转化反应的完全进行。接下来，我们将一系列KDO基因异源表达在工程菌株P. taiwanensis VLB120?C?3中。在含有能够羟基化L-赖氨酸C-4位的KDO的菌株中，我们评估了L-赖氨酸的羟基化反应，同时利用D-木糖通过Weimberg途径提供α-KG。最终，我们发现其中三种最具潜力的整体细胞生物催化剂，并研究了底物L-赖氨酸浓度增加以及金属辅因子Fe²⁺的影响。最后，表达来自黄杆菌属（Flavobacterium）物种的KDO的工程菌株在搅拌罐生物反应器中培养，能够产生8.7 ± 0.3克/升的羟基-L-赖氨酸，时空产率为98.6 ± 3.4毫克/升·小时，催化剂特异性产率为1.68 ± 0.07克/克干重（Y_Hyl/X）。通过Weimberg途径供应α-KG的效率非常高，因为几乎每两个被转化为中央碳代谢的D-木糖分子都参与了生物转化反应（Y_Hyl/Xyl,net = 0.48 ± 0.02摩尔/摩尔）。

结论

我们成功构建了一种用于从L-赖氨酸和D-木糖合成羟基-L-赖氨酸的整体细胞生物催化剂，并利用我们的工程菌株实现了多克级别的生产。我们的工作为利用Fe²⁺/α-酮戊二酸依赖性氧化酶、通过Weimberg途径驱动的整体细胞生物工艺奠定了基础。