《Acta Neuropathologica》：TSC-associated microglial hyperactivity: enhanced calcium signaling, metabolism, and phagocytosis
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为探索结节性硬化症（TSC）复杂神经病理中常被忽视的小胶质细胞作用，研究人员结合单细胞转录组学与诱导多能干细胞（iPSC）衍生小胶质样（iMGL）细胞模型展开研究。结果首次发现TSC小胶质细胞存在显著钙（Ca2+）信号失调，具体表现为储存操控性钙离子内流（SOCE）受损和线粒体Ca2+摄取增加，并伴有线粒体呼吸活性升高、吞噬活动增强和炎症反应改变，呈现出类似疾病相关小胶质细胞（DAM）的过度活化表型。该研究提示小胶质细胞功能障碍可能是TSC病理生理学的一个相关组分，为理解TSC中mTOR通路过度激活如何影响非神经元细胞提供了新视角。
长期以来，结节性硬化症（Tuberous Sclerosis Complex, TSC）的研究焦点主要集中在神经元和星形胶质细胞上。这种由TSC1或TSC2基因功能缺失性突变引起的遗传性疾病，以大脑皮质结节、顽固性癫痫（Epilepsy）和一系列神经精神共病（TANDs）为特征，其核心病理机制是雷帕霉素机制靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）信号通路的过度激活。然而，作为大脑主要的免疫哨兵和稳态维护者，小胶质细胞（Microglia）在TSC中的角色却被极大地忽视了。这些细胞在健康状态下持续监测微环境，并在神经损伤或异常活动时快速反应，其功能异常与癫痫和认知缺陷密切相关。那么，在mTOR信号失控的TSC大脑中，小胶质细胞究竟扮演了怎样的角色？它们的功能状态是否也发生了改变，从而可能加剧了疾病的进展？这项发表于《Acta Neuropathologica》的研究，为我们揭开了TSC中小胶质细胞功能障碍的神秘面纱。
为了解答这些问题，研究人员开展了整合性研究。首先，他们分析了从TSC患者切除的脑组织样本（n=5）和年龄、区域匹配的尸检对照样本（n=3）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据。其次，他们从手术切除的TSC病灶中分离出星形胶质细胞，并重新编程建立了七株患者来源的诱导多能干细胞（iPSC）系，与五株对照iPSC系一同，进而分化成iPSC衍生的小胶质样（iMGL）细胞，作为研究TSC小胶质细胞功能的体外模型。利用这些细胞，研究团队系统性地评估了钙离子（Ca2+）信号传导、线粒体呼吸功能以及吞噬活性等关键功能。
研究团队首先从TSC患者大脑的转录组学分析中发现了线索。通过对切除的TSC脑组织进行单细胞RNA测序分析，他们发现，与对照组相比，TSC来源的小胶质细胞中，大量与钙（Ca2+）信号调控相关的基因表达发生了显著改变。这预示着TSC小胶质细胞可能存在钙信号通路的紊乱。
Ca2+信号失调在TSC小胶质细胞中的功能验证
为了验证这一发现并深入探究其功能后果，研究转向了iPSC模型。他们成功地从TSC患者和健康对照个体的星形胶质细胞中，通过重新编程生成了功能性的iPSC，并将其分化为具有典型小胶质细胞形态和标志物（如IBA1和TMEM119）表达的iMGL细胞。利用这一模型，研究人员直接测量了细胞内的钙离子动态。
当使用ATP（三磷酸腺苷，一种常见的损伤相关分子模式）刺激时，TSC iMGL细胞表现出更强烈的胞质钙离子（[Ca2+]c）反应峰值，表明它们对刺激信号更为敏感，处于一种“过度反应”状态。
SOCE功能受损
储存操控性钙离子内流（Store-Operated Calcium Entry, SOCE）是细胞在钙库耗竭后，从细胞外补充钙离子的主要机制。通过先耗竭内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）钙库，再重新添加细胞外钙的实验，研究发现TSC iMGL细胞的SOCE能力显著降低。这表明，尽管它们对刺激的反应增强，但通过SOCE途径补充钙库的能力却存在缺陷。
线粒体Ca2+摄取增加与代谢增强
钙离子信号与细胞代谢紧密相连。研究者进一步测量了线粒体内的钙离子浓度（[Ca2+]m）。结果显示，在ATP刺激下，TSC iMGL细胞线粒体摄入的钙离子显著多于对照细胞。由于线粒体钙离子是驱动三羧酸循环（TCA cycle）关键酶活性的重要信号，这一变化预示着线粒体代谢可能被激活。随后的高分辨率呼吸测量法（Oroboros Oxygraph-2k）实验证实了这一点：TSC iMGL细胞的基础呼吸（Routine respiration）和最大呼吸容量（Electron Transport capacity）均显著升高，表明其线粒体耗氧率和整体代谢活性增强。
吞噬功能亢进与炎症反应改变
除了钙信号和代谢，研究还考察了小胶质细胞的核心功能——吞噬作用。通过将pH敏感的荧光染料标记的人类胎儿脑组织来源的粗制突触体（Crude synaptic fraction）与iMGL细胞共培养，并使用活细胞成像系统（IncuCyte S3）进行量化，研究发现TSC iMGL细胞的吞噬活性显著高于对照细胞。在炎症反应方面，当用脂多糖（LPS）刺激时，虽然TSC和对照iMGL细胞都上调了促炎因子（如IL-6、IL-1β）和抗炎因子（IL-10）的表达，但TSC iMGL细胞在静息状态和LPS刺激后，肿瘤坏死因子α（TNFα）的表达水平均低于对照，提示其炎症反应模式可能发生了特定的改变。
分子层面的证据
为了寻找这些功能改变的分子基础，研究团队通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫印迹（Western blot）分析了钙信号相关蛋白的表达。他们发现，尽管在mRNA水平上只有少数基因（如STIM2、MCUB）表达下调，但在蛋白质水平上，内质网上的钙离子释放通道三磷酸肌醇受体（IP3R）和钙泵（SERCA2）的表达均显著上调。这或许解释了为何TSC iMGL细胞内质网钙库容量未变，却能释放出更强的钙信号。
总结与讨论
综上所述，这项研究通过结合人脑组织转录组学分析和iPSC衍生细胞模型，首次系统揭示了TSC中小胶质细胞的“过度活跃”表型。这种表型表现为：1) 对ATP刺激的胞质钙信号反应增强；2) SOCE功能受损；3) 线粒体钙摄取增加并伴随代谢活性增强；4) 吞噬功能亢进；5) 炎症反应谱改变。这些特征部分与在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中描述的“2期疾病相关小胶质细胞”表型重叠，提示TSC中的小胶质细胞可能处于一种慢性的、失调的激活状态。
研究的结论部分强调，小胶质细胞的这种功能失调可能是TSC病理生理学中一个先前被低估的关键组分。mTOR信号通路的过度激活不仅直接影响神经元和星形胶质细胞，也深刻地重塑了小胶质细胞的钙信号、能量代谢和免疫功能。这种“过度活跃”的小胶质细胞可能通过过度的突触修剪、异常的细胞因子释放以及能量代谢失衡，加剧神经网络异常和神经炎症，从而促进TSC相关的癫痫发作和神经精神症状。这项研究不仅拓宽了我们对TSC多细胞病理机制的理解，也为针对小胶质细胞功能进行干预，开发新的治疗策略（如调节钙稳态或代谢重编程）提供了潜在的理论依据和实验模型。未来研究需要进一步阐明TSC小胶质细胞过度活跃的上游mTOR调控机制及其在活体动物模型中对神经网络和行为的实际影响。
