《Acta Neuropathologica》：D178N prion protein mutation endows RML prions with new strain properties that do not mimic human genetic prion diseases
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本文探讨了遗传性朊病毒病中，D178N突变如何影响朊病毒株的形成与传播。研究人员利用转基因小鼠模型和蛋白错误折叠循环扩增技术（PMCA），发现D178N突变虽能促使RML朊病毒产生新型菌株，但这些菌株在传播性、生化特性和神经病理特征上均与人类致命性家族性失眠症（FFI）和遗传性克雅病（CJD178）不同。该研究揭示了自发与模板驱动的朊蛋白生成可能遵循不同的机制路径，为理解遗传性PRNP突变如何影响朊病毒株特性提供了新视角。
遗传性朊病毒病：当突变遇上朊病毒，会产生怎样的新特性？
朊病毒病是一类由朊蛋白（PrP）错误折叠引发的致命性神经退行性疾病。其中，遗传性朊病毒病由PRNP基因突变引起，约占人类病例的15%。D178N突变是一个典型的例子：当它与129位密码子编码的蛋氨酸（M129）组合时，导致致命性家族性失眠症（Fatal Familial Insomnia， FFI）；而与缬氨酸（V129）组合时，则引起遗传性克雅病（Genetic Creutzfeldt–Jakob Disease， CJD178）。这两种疾病在临床表现和神经病理上截然不同，传统观点认为，这种差异源于突变蛋白折叠成了不同的、具有自我复制能力的致病性朊蛋白异构体（PrPSc），即不同的“朊病毒株”。
然而，一个长期困扰研究者的问题是：携带这些突变的小鼠模型（如本研究使用的Tg(FFI)和Tg(CJD)小鼠）虽然能自发产生与人类疾病相似的神经症状和轻度蛋白激酶K（PK）抗性的PrP聚集物，但这些聚集物却无法传播给其他小鼠，即不产生典型的、具有传染性的PrPSc。这引出了核心疑问：D178N突变本身是否足以驱动形成具有传染性的、能精准模拟人类FFI或CJD178的朊病毒株？还是说，自发形成的病理性PrP与在已有“种子”模板下形成的PrPSc有着根本性的区别？为了回答这些问题，Roberto Chiesa等研究人员在《Acta Neuropathologica》上发表了一项深入的研究。
关键技术方法概览
研究团队运用了多种前沿技术。他们首先使用高灵敏度的实时震动诱导转化（RT-QuIC）和具有广泛易感性的田鼠（bank vole）生物测定法，确认了自发发病的转基因小鼠大脑中缺乏可检测的朊病毒播种活性或感染性。核心实验是利用蛋白错误折叠循环扩增（PMCA）技术，以RML（一种小鼠适应的瘙痒毒株）朊病毒为“种子”，在体外以Tg(FFI)和Tg(CJD)小鼠的脑匀浆为底物，成功生成了高度PK抗性的突变型朊病毒（分别命名为RMLFFI和RMLCJD）。随后，他们将这些体外生成的朊病毒接种到过表达野生型PrP的Tga20小鼠和C57BL/6J小鼠中进行系列传代实验，系统评估了其传播效率、潜伏期、PrPSc的生化特性（如糖基化模式、蛋白水解片段大小、构象稳定性）以及诱导的神经病理变化。研究中还使用了多种针对PrP不同表位的抗体进行Western blot分析，并通过构象稳定性实验（CSA）比较了不同朊病毒株的物化特性。神经病理学分析则包括苏木精-伊红（H&E）染色、免疫组织化学和硫黄素S染色。
研究结果
1. RT-QuIC与田鼠生物测定均未在自发发病小鼠中检测到朊病毒活性
研究人员使用以田鼠PrP为底物的RT-QuIC检测发现，Tg(FFI)和Tg(CJD)小鼠脑匀浆的播种活性至少比人类FFI和CJD178患者脑组织低104-105倍。同时，将这些小鼠脑匀浆接种到对多种朊病毒高度易感的田鼠体内，也未引发疾病或检测到PrPres。这些结果共同证实，这些转基因小鼠大脑中积累的突变PrP聚集物不具备可传播的感染性。
2. 体外生成的RMLFFI和RMLCJD朊病毒可在小鼠中传播，但特性独特
当使用RML种子通过PMCA转化突变PrP后，产生的RMLFFI和RMLCJD朊病毒能够感染Tga20小鼠并实现连续传代。然而，与亲本RML菌株相比，它们表现出显著延长的潜伏期（即使在多次传代后仍稳定在约320天），并且对C57BL/6J小鼠的传播效率极低（仅引起亚临床感染）。这表明，D178N突变赋予RML一种新的、稳定的菌株特性，而非简单的序列不匹配导致的传播障碍。
3. RMLFFI和RMLCJD生化特性相似，且均不同于RML
对感染小鼠脑组织中PrPres的分析显示，无论最初使用的突变底物是D177N–M128还是D177N–V128（小鼠同源序列），产生的RMLFFI和RMLCJD朊病毒具有几乎相同的生化特征：
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糖基化模式：二者均以双糖基化PrP为主，而RML则以单糖基化形式为主。
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蛋白水解片段：使用SAF84抗体（识别162–168表位）检测时，二者均产生一个额外的~14 kDa C末端片段，并且富含经ADAM10蛋白酶切产生的、缺乏膜锚定的“脱落型”PrP（shed PrP），其含量比RML感染小鼠高20-30倍。
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构象稳定性：构象稳定性实验表明，RMLFFI和RMLCJD的PrPSc构象均一，其[GdnHCl]1/2值（使50% PrPres对PK敏感的盐酸胍浓度）相似，且显著区别于RML。RML的N末端区域在低浓度GdnHCl下即变得不稳定，而RMLFFI/CJD的PrPSc核心则表现出整体一致的稳定性。
4. RMLFFI和RMLCJD诱导相似的独特神经病理改变
神经病理学分析进一步将RMLFFI/CJD与RML区分开来。RMLFFI和RMLCJD感染的小鼠在大脑和小脑皮层出现强烈的海绵状病变，而RML感染则无此现象。更显著的是，RMLFFI和RMLCJD感染小鼠脑中出现了大量RML感染所没有的、巨大的软膜下和血管周围淀粉样斑块。免疫组化证实，这些斑块富含上述的“脱落型”PrPSc。
结论与意义
本研究得出了几个关键结论：首先，自发积累在Tg(FFI)和Tg(CJD)小鼠脑中的D177N突变PrP聚集物不具备可传播的感染性，这与人类FFI/CJD178患者脑中存在传染性PrPSc形成鲜明对比，提示自发形成与模板诱导的朊蛋白致病构象可能遵循不同的分子路径。
其次，也是更重要的发现是，当D178N突变体PrP在RML朊病毒模板的驱动下发生错误折叠时，它并未产生模拟人类FFI或CJD178的朊病毒株。相反，无论129位密码子是M还是V，D178N突变都引导RML朊病毒“转型”成为一种全新的、稳定的菌株（RMLFFI/CJD）。这种新菌株具有独特的生物学特性：传播能力弱、潜伏期长、生化特征一致（相同的PrPres片段、糖基化模式和构象稳定性），并诱发独特的神经病理表型（如富含脱落型PrP的大斑块）。
这项工作揭示了遗传性PRNP突变影响朊病毒株特性的复杂方式。它表明，突变本身并不直接“编码”一个特定的、对应人类疾病的朊病毒株结构。朊病毒株的最终特性是突变序列与所遭遇的特定“种子”模板（本研究中的RML）之间相互作用的结果。D178N突变似乎赋予朊病毒一种强烈的“固有倾向”，使其偏离原始模板（RML）的复制模式，形成一个稳定的新构象，且该构象不受129位多态性的影响。这为理解为何同一突变（如D178N）会导致不同疾病表型（FFI vs. CJD）提供了新的思考维度，即除了突变和多态性，初始的“触发”事件或存在的PrPSc种子可能共同决定了最终的疾病类型。此外，该研究也展示了PMCA技术在探索朊病毒株生成与演化机制方面的强大能力。
