利用基于重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）或嵌套PCR（Nested PCR）结合CRISPR–Cas12a技术的侧向流动测定法（Lateral Flow Assay），快速简便地检测Enterocytozoon bieneusi

《Acta Parasitologica》：Rapid and Simple Detection of Enterocytozoon Bieneusi Using Lateral Flow Assay Based on Recombinase Polymerase Amplification or Nested PCR Combined with CRISPR–Cas12a

本研究开发了一种结合巢式PCR和CRISPR-Cas12a的高灵敏检测方法，用于诊断人畜共患的Enterocytozoon bieneusi感染。该方法通过优化反应参数和多种检测手段验证，检测限分别为7.13 copies/μL和2.35×10^-2 copies/μL，结果一致，显著提升诊断效率和准确性。

　　

摘要

背景

Enterocytozoon bieneusi是一种专性细胞内微孢子虫病原体。它主要导致感染者出现腹泻和体重下降，给畜牧业带来巨大的经济损失。因此，建立一种高灵敏度和特异性的检测方法对于预防和控制这种病原体至关重要。

方法

基于E. bieneusi的18S核糖体RNA基因和内部转录间隔区（ITS）的部分序列，设计了crRNA和重组酶聚合酶扩增（RPA）引物。从粪便样本中提取的DNA通过RPA或嵌套聚合酶链反应（PCR）进行扩增。PCR扩增产物经过Tris饱和苯酚-氯仿-异戊醇混合物处理以获得纯化的目标DNA，随后将其引入CRISPR–Cas12a反应系统。反应后的检测通过qPCR仪器、荧光观察和侧向流动条（LFS）试验进行。通过RPA/CRISPR–Cas12a或嵌套PCR/CRISPR–Cas12a平台优化了E. bieneusi检测的操作参数。该方法使用50份已知E. bieneusi感染状态的临床样本进行了验证。

结果

RPA/CRISPR–Cas12a的检测限为7.13拷贝/μL，嵌套PCR/CRISPR–Cas12a的检测限为2.35 × 10^?2拷贝/μL。当CRISPR–Cas12a反应系统中未扩增DNA的浓度达到≥1 × 10^?4 μg/μL时，单链DNA报告基因会被有效切割，产生可检测的荧光信号。使用嵌套PCR/CRISPR–Cas12a技术分析了50份确认为E. bieneusi阳性或阴性的粪便样本。基于仪器的检测结果、荧光观察和侧向流动条检测结果完全一致。

结论

我们首次实现了嵌套PCR与CRISPR–Cas12a的结合，用于检测E. bieneusi，同时也是首次使用未扩增的E. bieneusi DNA定量探索Cas12a的检测限。该方法提供了一种快速、特异且高度敏感的诊断手段。此外，多种适当的可视化方法的选择使其能够适应不同的实验室条件和样本模板浓度，从而确保结果的准确解读。