《Immunity, Inflammation and Disease》：Deficiency of NF-Erythroid 2-Related Factor 2 Exacerbates the Scar Through ERK Signaling Pathway
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本文揭示了转录因子NF-Erythroid 2-Related Factor 2（Nrf2）在皮肤损伤后瘢痕形成中的关键作用及其机制。研究发现，Nrf2缺失会延迟伤口愈合，并通过增强炎症反应、激活成纤维细胞、促进胶原合成来加剧瘢痕增生，其核心机制涉及细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的持续激活。本研究为靶向Nrf2/ERK轴以改善瘢痕预后提供了新的理论依据和治疗思路。
1 引言
皮肤创伤后的伤口愈合是维持皮肤稳态的关键过程，细胞外基质（ECM）重塑在其中扮演着重要角色。此过程的任何异常都会导致伤口愈合过度或瘢痕形成。目前，临床广泛使用手术、激光、药物等方法治疗瘢痕，但这些方法常存在患者依从性差、疗效不尽如人意等显著缺点。因此，进一步探索瘢痕形成的发病机制至关重要。
瘢痕主要由结构不良且排列紊乱的胶原纤维组成，其形成与ECM重塑密切相关，而成纤维细胞是参与此过程的主要细胞类型。在伤口愈合过程中，异常活化的成纤维细胞会产生过量的胶原、透明质酸、纤连蛋白和蛋白聚糖，导致胶原过度合成和细胞外基质沉积。虽然成纤维细胞活化在瘢痕形成中至关重要，但其潜在机制尚不完全清楚。近期研究表明，炎症因子和活性氧（ROS）在调节成纤维细胞活化中起关键作用，该过程涉及多种信号通路。其中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，尤其是细胞外信号调节激酶（ERK）通路，在成纤维细胞的活化和增殖中至关重要。因此，通过ERK信号通路调节成纤维细胞介导的炎症和胶原合成对于瘢痕进展至关重要。
NF-Erythroid 2-Related Factor 2（Nrf2）是一种敏感的氧化还原转录因子。Nrf2及其内源性抑制剂Kelch样ECH关联蛋白1（Keap1）在调节促炎/抗炎反应平衡和氧化过程中发挥重要作用。研究证实，Nrf2主要参与伤口愈合的增殖期，通过促进上皮细胞增殖和迁移、同时减少氧化应激和细胞凋亡来加速伤口愈合。考虑到炎症可以触发成纤维细胞活化，研究人员推测Nrf2可能影响瘢痕形成。
本研究利用Nrf2基因敲除（Nrf2-KO）和野生型（WT）小鼠探讨Nrf2在瘢痕形成中的作用。结果揭示了Nrf2缺失可能通过增加炎症反应和胶原沉积来促进成纤维细胞活化。因此，本研究结果突显了Nrf2在胶原合成和瘢痕形成中的重要作用，为瘢痕治疗提供了新的见解和潜在的分子靶点。
2 材料与方法
本研究采用了多种分子生物学、细胞生物学和组织学技术。使用8周龄雄性C57BL/6J背景的Nrf2-KO小鼠和同窝野生型对照小鼠，在其背部制作6毫米直径的全层皮肤切口伤模型。通过ImageJ软件每日测量伤口面积以评估愈合速度，直至伤后第12天完全愈合。对愈合后的瘢痕组织进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色，分别评估组织形态和胶原沉积。通过免疫组织化学（IHC）检测增殖细胞核抗原（PCNA）和波形蛋白（Vimentin）的表达。使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测瘢痕组织中炎症因子（如白细胞介素-6（IL-6）、CXC趋化因子配体-1（CXCL-1）、转化生长因子-β1（TGF-β1）等）、氧化应激相关因子（如超氧化物歧化酶1（SOD1）、血红素加氧酶-1（HO-1）等）以及胶原合成相关基因（如胶原蛋白I型α1链（COL1A1）、胶原蛋白VI型α1链（COL6A1）、基质金属蛋白酶（MMPs）等）的mRNA表达水平。通过蛋白质印迹（Western Blot）检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、COL6A1以及磷酸化ERK（pERK）和总ERK的蛋白表达。从新生小鼠背部皮肤分离培养原代皮肤成纤维细胞，并利用细胞划痕实验评估细胞迁移能力。此外，使用佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（TPA）刺激成纤维细胞，并通过免疫荧光（IF）染色观察pERK的核定位情况。所有统计分析均使用GraphPad Prism软件进行。
3 结果
3.1 Nrf2缺失延迟伤口愈合并加剧瘢痕形成
研究发现，在伤口愈合早期，Nrf2-KO小鼠的伤口愈合速度显著慢于野生型小鼠。HE染色显示，Nrf2-KO小鼠瘢痕区域表皮显著增厚。Masson染色进一步表明，Nrf2缺失显著加剧了胶原沉积和瘢痕形成。这些结果表明，Nrf2的缺失显著延迟了愈合早期阶段并加剧了瘢痕形成。
3.2 Nrf2缺失在体内加剧瘢痕胶原合成
免疫组化结果显示，两组间PCNA和波形蛋白的表达无差异。然而，qRT-PCR检测发现，在Nrf2-KO小鼠的瘢痕组织中，炎症因子（IL-6、CXCL-1、CXCL-2、TGF-β1）的表达升高，而抗氧化应激因子（SOD1、SOD2、HO-1、GSH1）的表达减弱。同时，胶原合成相关因子（COL1A1、COL6A1、COL17A1、波形蛋白、α-SMA、纤连蛋白1（FN1））和多种MMPs的mRNA表达水平在Nrf2-KO小鼠中显著上调。蛋白质印迹结果也证实，Nrf2-KO小鼠瘢痕组织中α-SMA和COL6A1的蛋白表达水平更高。这些发现表明，Nrf2缺失促进了瘢痕中的胶原合成和沉积。
3.3 Nrf2缺失在体外加剧成纤维细胞胶原合成
细胞实验发现，Nrf2-KO抑制了成纤维细胞的增殖和迁移。用TPA刺激成纤维细胞后，qRT-PCR检测显示，与野生型成纤维细胞相比，Nrf2缺失显著促进了炎症和胶原相关基因的表达上调。这表明Nrf2-KO在体外抑制了细胞迁移并加剧了成纤维细胞的胶原合成。
3.4 Nrf2缺失通过ERK信号通路在体内外加剧瘢痕
研究检测了体内pERK的水平，发现Nrf2缺失显著上调了瘢痕组织中ERK的磷酸化。在体外，TPA刺激后，免疫荧光染色显示，Nrf2-KO显著促进了pERK的核定位。这些发现表明，Nrf2缺失可能通过ERK信号通路加剧瘢痕。
4 讨论
炎症是伤口愈合的关键阶段，严重或持续的炎症反应与伤口愈合延迟和瘢痕形成直接相关。Nrf2在炎症反应中扮演重要角色。本研究和前期工作发现，Nrf2缺失上调了成纤维细胞中与胶原合成密切相关的炎症因子，如IL-1α和IL-6。这表明Nrf2缺失可能通过促进炎症反应来影响胶原合成。此外，胶原合成相关基因的表达在瘢痕形成中至关重要。本研究发现，Nrf2缺失导致成纤维细胞中胶原合成相关基因（如MMP3、MMP8、MMP9、COL1A1和COL3A1）的表达更高。这表明Nrf2缺失可能直接调控胶原合成相关基因的表达。TPA刺激后，与对照组相比，这些基因的表达增加更为显著。这表明Nrf2缺失可能通过激活炎症、促进成纤维细胞活化，从而增强成纤维细胞中的胶原合成来加剧瘢痕形成。总体而言，Nrf2一方面可以直接调控胶原相关合成基因的表达，另一方面可能通过调节炎症反应来调控胶原合成相关基因的表达，从而影响胶原合成和瘢痕形成。
近期研究发现，瘢痕形成与多种信号通路有关，包括MAPK、TGF-β/Smad、整合素/粘着斑激酶（FAK）、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路。本团队前期研究发现，TPA刺激后，Nrf2-KO成纤维细胞中ERK的磷酸化水平升高。在使用两种ERK抑制剂（U0126和PD98059）后，Nrf2-KO成纤维细胞中的pERK水平显著降低，这表明Nrf2缺失可能通过ERK信号通路激活成纤维细胞并促进炎症反应。许多研究也表明，ERK激活不仅与炎症密切相关，还与成纤维细胞介导的胶原沉积有关。本研究数据与之一致，显示TPA刺激增加了Nrf2-KO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的胶原表达，而ERK抑制剂处理则抑制了胶原沉积。这些发现表明，Nrf2可能通过ERK信号通路抑制成纤维细胞介导的炎症，从而抑制异常的胶原合成并减缓伤口愈合。
此外，Nrf2是一个关键的氧化还原转录因子，调节氧化应激反应。同时，氧化应激在瘢痕形成中也起着至关重要的作用。本研究发现，Nrf2缺失通过下调成纤维细胞中HO-1等抗氧化因子的表达来增强炎症反应。对瘢痕中氧化应激因子水平的检测结果与前期研究一致。这表明Nrf2也可能通过氧化应激途径影响瘢痕形成。
尽管本研究取得了一些重要发现，但仍存在一些局限性。首先，研究主要基于小鼠模型和成纤维细胞培养，可能无法完全反映人类瘢痕形成的复杂过程。其次，本研究的机制探索主要集中于炎症、氧化应激和MAPK信号通路的ERK分支，而其他MAPK通路（如p38和c-Jun N-末端激酶（JNK））有待进一步研究。第三，研究主要关注成纤维细胞，而角质形成细胞、免疫细胞和内皮细胞在瘢痕形成中也扮演重要角色，但本研究未完全涉及。最后，本研究缺乏在人临床瘢痕样本中的验证，因此其转化潜力有待进一步确认。
未来的研究应整合多种信号通路，以更全面地阐明Nrf2在瘢痕形成中的作用。利用单细胞测序等先进技术可能有助于揭示成纤维细胞与其他皮肤常驻细胞之间的相互作用。此外，在人类瘢痕组织中验证这些发现，并探索通过药理学或遗传学方法调控Nrf2的可行性，可能为瘢痕治疗提供新方向。长期研究对于评估靶向Nrf2是否不仅能改善瘢痕形成，还能促进皮肤损伤后的功能恢复也将具有重要价值。
