《Molecular Oncology》：Pre-analytical optimization of cell-free DNA and extracellular vesicle-derived DNA for mutation detection in liquid biopsies
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这篇前瞻性与回顾性研究系统评估了处理延迟、存储温度、采血管类型和血浆输入体积四个关键分析前变量，对血浆来源的细胞游离DNA（cfDNA）与胞外囊泡来源DNA（evDNA）浓度、质量及KRASmut突变检测性能的影响。研究结果揭示：evDNA在次优条件下比cfDNA更稳定；血浆（而非提取后DNA）冻存（-80°C）会显著损害DNA质量和突变检出；ACD管与K2EDTA管在及时处理时性能相当；增加血浆体积能提升evDNA的突变检测灵敏度。研究为优化临床液体活检的标准化工作流程提供了直接、实用的循证建议，对确保结果可靠与临床转化意义重大。
引言：标准化的必要性
液体活检通过分析循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞和外泌体等成分，为肿瘤的无创、实时分子监测提供了革命性工具。然而，其分析性能很大程度上受限于样本采集与处理过程中的分析前因素。细胞游离DNA（cfDNA）主要来自凋亡或坏死的肿瘤细胞，极易降解；而由活细胞主动分泌的胞外囊泡所携带的DNA（evDNA），其脂质双分子膜结构使其核酸内容物受到保护，理论上具有更高的稳定性。尽管如此，两种分析物在临床应用前仍面临挑战，尤其是缺乏针对关键分析前变量（如处理延迟、存储温度、采血管类型和血浆体积）的系统性比较与标准化指南。本研究旨在通过对癌症患者血浆样本进行前瞻性及大样本回顾性分析，为优化cfDNA与evDNA的液体活检工作流程提供实证依据。
材料与方法：系统性评估的设计
研究共纳入244例前瞻性血浆样本（患者来源为胰腺导管腺癌PDAC或结直肠癌CRC），并利用723例存档样本进行验证。通过数字液滴PCR（ddPCR）、Qubit荧光定量和TapeStation片段分析等方法，系统评估了四个关键变量：
- 1.
处理延迟队列（n=32）：在室温下，将全血样本延迟处理至1、3、6、12、24、48、96小时。
- 2.
存储温度队列：分为三部分，分别评估血浆-80°C冻存两周的影响、提取后DNA在-80°C存储的影响，以及血浆在4°C和-80°C短期储存过夜的影响。
- 3.
采血管队列（n=12）：对比酸性柠檬酸葡萄糖（ACD）管与二钾乙二胺四乙酸（K2EDTA）管的性能。
- 4.
血浆输入体积队列（cfDNA：n=55；evDNA：n=51）：评估从1、5、10毫升血浆中提取DNA的效果。
所有样本均采用标准化的超速离心法分离EV和QIAamp提取试剂盒提取DNA，并以KRAS基因突变（KRASmut）作为代表性分子读值进行分析。
结果一：延迟处理的影响——cfDNA比evDNA更早发生变化
在前瞻性队列中，室温延迟处理导致cfDNA浓度在24小时后显著上升，而evDNA浓度则在48小时后才显著增加。对723例存档样本的回顾性分析验证了这一趋势，但变化发生更早：cfDNA浓度在6小时后即升高，而evDNA浓度在24小时后上升。片段分析则显示，cfDNA和evDNA的片段长度在96小时内均未发生显著变化。
这一结果表明，evDNA在延迟处理条件下比cfDNA更具抵抗力，其囊泡结构提供了一定的保护作用。
结果二：温度的影响——血浆冷冻损害DNA质量，evDNA更具韧性
长期储存研究发现，将血浆在-80°C冷冻两周会显著降低cfDNA的浓度、KRASmut等位基因频率和可扩增基因组当量。evDNA的浓度和可扩增基因组当量也随冷冻下降，但其KRASmut等位基因频率基本保持稳定。
短期储存对比发现，4°C冷藏是比-80°C冷冻更好的短时保存方案。与立即处理的样本相比，4°C储存仅轻微降低cfDNA产量，却比-80°C冷冻更能保护DNA质量；对evDNA而言，4°C储存的影响更小。
关键发现是，已提取的cfDNA和evDNA在-80°C储存两周后保持稳定，表明降解主要发生在血浆冷冻过程中，而非纯化后的DNA存储阶段。
结果三：采血管类型——ACD管与K2EDTA管在及时处理下性能相当
在采血管队列中，当血液在采集后3小时内处理时，ACD管和K2EDTA管在cfDNA和evDNA的产量上均未显示出统计学显著差异，两者高度相关。这支持了在能够确保快速处理的前提下，两种标准非稳定化采血管可以互换使用的结论。
结果四：血浆输入体积——增加体积对提升evDNA突变检测灵敏度更关键
对于cfDNA，尽管增加血浆体积（从1毫升到10毫升）能显著提升DNA总产量（浓度和可扩增基因组当量），但KRASmut的检出率在ddPCR分析中并未随体积增加而显著改善，1毫升血浆通常已足够。
相比之下，对于evDNA，增加血浆输入体积不仅显著提高了DNA产量，还直接改善了突变检测的灵敏度。有多个样本在1毫升时为阴性，但在5毫升或10毫升时转为KRASmut阳性。这表明，为优化evDNA的突变检测，建议使用至少5毫升的血浆。
讨论：从数据到实践指南
本研究通过结合前瞻性对照和大规模回顾性验证，系统评估了分析前变量，为液体活检工作流程提供了具体优化建议。研究发现，evDNA在延迟处理和温度波动下表现出比cfDNA更强的韧性，这与其被囊泡包裹的结构特性相符。然而，鉴于evDNA分离过程复杂、耗时且成本高，cfDNA目前仍是临床常规应用更可行的分析物。
研究结果与当前部分最佳实践指南一致，并提供了更精确的量化数据：对于使用ACD管的样本，建议在6小时内处理以获得可靠的cfDNA结果，evDNA的处理窗口可延长至24小时；当无法立即提取时，短期存储首选4°C，而长期保存应将DNA提取后再进行-80°C冷冻；在快速处理条件下，ACD管和K2EDTA管可互换使用；对于evDNA分析，推荐使用≥5毫升血浆以优化检测灵敏度。
尽管研究聚焦于KRAS突变和特定癌症类型，且主要使用ddPCR平台，但这些关于分析前变量影响的基本原理很可能适用于其他突变、肿瘤类型及检测技术（如下一代测序NGS）。
结论：迈向标准化的液体活检
本研究强调了分析前标准化对液体活检结果可靠性和临床意义的关键作用。通过阐明处理延迟、存储温度、采血管和血浆体积如何影响cfDNA和evDNA，我们为建立更一致、更可靠的检测流程提供了实证基础。随着液体活检在早期癌症检测、治疗分层和纵向监测中的作用日益重要，采用并遵循严格、标准化的操作程序，将是确保其在临床实践和研究中发挥最大潜力的基石。
