《Journal of Biological Engineering》：Bioreactor expansion of human neural progenitor cells for exosome scalable production and miRNA-engineering
编辑推荐：
本研究通过比较垂直轮式（PBS）与搅拌式（DASbox）生物反应器，评估了其规模化生产人类神经祖细胞（NPC）源外泌体的能力，并探索了载有miR-124-3p的工程化外泌体（sEVs）作为无细胞疗法，在体外模型中调节神经-胶质稳态与炎症、治疗神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的潜力。
应用生物反应器规模化扩增人类神经祖细胞以生产外泌体并进行miRNA工程
背景
所有活细胞都会释放细胞外囊泡，其中直径小于200纳米的通常被称为外泌体。外泌体作为一种有前景的无细胞治疗递送系统，其重要性日益增长，美国国立卫生研究院临床试验数据库已收录246项相关研究。神经祖细胞移植因其免疫原性和单次给药局限性面临挑战，而NPC来源的外泌体则展现出低免疫原性、高生物相容性、穿越血脑屏障能力和神经再生特性等优势。然而，大规模生产高质量外泌体是其生物医学应用的一大挑战。传统的二维（2D）贴壁培养因生长面积有限导致外泌体产量低，而三维（3D）生物反应器培养则提供了一个更接近生理的环境，有利于实现可扩展的工艺生产。
本研究旨在通过高级3D培养技术，利用PBS 0.1 Mini垂直轮式生物反应器和DASbox?Mini搅拌罐生物反应器，规模化生产ReNcell?VM人源神经祖细胞及其外泌体，并评估这些外泌体作为miR-124-3p递送载体的治疗潜力。
方法
人ReN VM细胞单培养与分化
使用源自人胎儿中脑腹侧的ReNcell?VM人神经祖细胞系。细胞在包被过的培养瓶中贴壁培养，使用含有生长因子的特定培养基维持。为了诱导神经元分化，在接种后次日去除生长因子并培养14天。
人ReN VM细胞神经球生物反应器培养
将未分化的ReN细胞分别接种于PBS 0.1生物反应器（工作体积60 mL）和DASbox生物反应器系统（工作体积80 mL）中，进行3D悬浮培养。PBS系统保持50 rpm恒定转速，而DASbox系统采用梯度转速以最小化剪切力，并严格控制pH、溶解氧和温度。每天取样分析神经球大小，每48小时更换80%培养基。
ReN细胞源外泌体的分离与表征
通过差速超速离心法从条件培养基中分离外泌体。使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）测定外泌体的大小和浓度，并通过Western blot检测外泌体标志物蛋白（Alix、Flotillin-1、CD63）以确认其身份和纯度。
ReN细胞源外泌体的PKH标记与转染
使用PKH26红色荧光染料标记外泌体以追踪其细胞靶向性。使用Exo-FectTM外泌体转染试剂盒将pre-miR-124-3p模拟物载入外泌体，并通过RT-qPCR验证装载效率。
细胞系培养与处理
使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系（野生型SH-WT和转染了APP695的SH-SWE）、CHME3人小胶质细胞系和IM-HA人永生化星形胶质细胞系。细胞在特定培养基中培养，并根据实验设计进行分化或应激处理。
PKH26标记外泌体的细胞摄取与免疫细胞化学
将等量的PKH26标记外泌体与靶细胞共孵育24小时后，固定细胞并进行免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜成像并利用FIJI软件和EVAnalyzer插件分析外泌体摄取情况。
基因与蛋白质表达分析
使用TRIzol法提取细胞总RNA，使用miRNeasy Micro Kit提取外泌体miRNA。通过RT-qPCR检测特定miRNA（miR-124-3p, miR-146a-5p, miR-155-5p, miR-21-5p, miR-125b-5p）和炎症相关基因的表达。通过Western blot分析神经祖细胞标志物（Sox2, Nestin）和神经元标志物（β-III-tubulin, Tau）的蛋白表达。
结果
DASbox生物反应器在ReN细胞扩增和外泌体生产中优于其他系统，且不改变囊泡直径
与2D贴壁培养相比，生物反应器系统显著提高了外泌体产量。DASbox生物反应器在总外泌体产出上比贴壁培养高出120倍以上。Western blot分析证实，来自2D和3D培养的外泌体均富含Alix和CD63等经典外泌体标志物。NTA分析显示，所有条件下分离的外泌体尺寸分布相似，平均直径在170-190纳米之间，无统计学差异。因此，DASbox生物反应器在保持外泌体特征性尺寸和分子特征的同时，是测试系统中规模化生产ReN细胞源外泌体最有效的平台。
与PBS系统相比，DASbox生物反应器能产生更小尺寸的ReN VM神经球和更高的外泌体产量
经过6天培养，PBS系统产生的神经球平均直径达到852.3 ± 35.7微米，而DASbox系统产生的神经球更小（452.4 ± 9.7微米）且尺寸更均匀。更小的聚集体可能由于更大的比表面积而增强营养扩散和废物交换，从而提高外泌体和生长因子的产量。尽管未达到统计学显著性，但DASbox生物反应器在培养后期显示出更高的外泌体浓度趋势，且累积产量有增高倾向。
神经分化标志物支持生物反应器扩增的VM ReN细胞为神经祖细胞
Western blot分析表明，在生物反应器中培养6天的ReN细胞，其干细胞标志物Sox2和Nestin的表达水平与未分化细胞相似，而成熟神经元标志物β-III-tubulin和Tau的表达则显著低于已分化的细胞。Sox2/β-III-tubulin、Nestin/β-III-tubulin等比率分析，以及无监督层次聚类结果均证实，生物反应器培养的细胞更接近未分化神经祖细胞的表型，表明两种生物反应器系统都能在扩增过程中维持细胞的主要NPC群体状态。
分化细胞和生物反应器扩增的ReN细胞来源的外泌体中miRNA略有富集
对一组炎症相关miRNA的分析显示，SH-WT细胞与ReN细胞来源的外泌体之间miRNA载货无显著差异。然而，在SH-WT细胞系内，未分化细胞来源的外泌体其miR-124-3p和miR-21-5p水平高于分化细胞来源的外泌体。初步的“外泌体/细胞miRNA比率”数据显示，分化细胞及DASbox生物反应器扩增的ReN细胞中，miRNA在外泌体中的富集程度更高。与贴壁培养相比，两种生物反应器系统培养的ReN细胞来源的外泌体，其miRNA（尤其是miR-124-3p、miR-146a-5p和miR-125b-5p）水平均有增高趋势，这可能增强其靶向受体细胞的效率。
miR-124-3p模拟物在ReN来源外泌体中的装载及向小胶质细胞的递送在DASbox生物反应器扩增的ReN细胞条件下得到改善
与模拟转染对照组相比，所有来源的外泌体在转染pre-miR-124-3p后，其miR-124-3p载货量均显著增加。值得注意的是，来自DASbox扩增ReN细胞的外泌体，其转染效率高于来自PBS生物反应器的外泌体。CHME3小胶质细胞能成功摄取所有来源的外泌体，且DASbox来源的外泌体显示出稍高的摄取趋势。转染了pre-miR-124-3p的外泌体处理能显著提高小胶质细胞内的miR-124-3p水平，其中DASbox来源的外泌体效果最为显著，表明其改善的细胞内化可能增强治疗效果。
负载miR-124-3p模拟物的DASbox规模化生产的外泌体能被神经胶质细胞摄取，并在细胞应激和炎症中发挥保护作用
PKH26标记的DASbox来源外泌体能被分化的SH-WT和SH-SWE神经元样细胞以及IM-HA星形胶质细胞有效摄取。在应激条件下（神经元用H2O2，星形胶质细胞用Liddelow混合因子，小胶质细胞用IFN-γ和H2O2），载有miR-124-3p的外泌体处理能显著调节这些细胞中炎症相关基因的表达。例如，在应激神经元中，其能降低促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA水平；在反应性星形胶质细胞中，能下调C3和Lcn2的表达；在活化小胶质细胞中，能降低TNF-α、IL-1β和IL-6的表达。这些效应在DASbox来源、转染了miR-124-3p的外泌体处理组中尤为明显，表明其具有更强的调节神经-免疫稳态的潜力。
讨论与结论
本研究表明，与传统的2D贴壁培养相比，使用生物反应器（尤其是DASbox系统）进行3D悬浮培养，能更高效地规模化生产人神经祖细胞及其外泌体，同时保持细胞的干性特征和外泌体的生物学特性。DASbox系统产生的神经球更小、更均匀，可能有利于营养物质交换和细胞功能。源自生物反应器扩增细胞的外泌体，其炎症相关miRNA载货有增加趋势，并显示出更高的miR-124-3p转染效率及被小胶质细胞摄取的潜力。
重要的是，载有神经保护性miR-124-3p的工程化外泌体，能够被神经元和胶质细胞有效摄取，并在多种细胞应激模型中差异性地调节关键的炎症介质，发挥抗炎和神经保护作用。这些发现凸显了生物反应器规模化生产的人类NPC来源外泌体，作为治疗神经退行性疾病（特别是那些涉及神经-胶质稳态失调和miRNA功能异常，如阿尔茨海默病）的创新治疗剂的前景。该研究为开发基于工程化外泌体的、可扩展的无细胞治疗策略提供了重要依据。
