CRISPR-Cas12a/Cas13a双酶切割技术在基孔肯雅病毒和登革热病毒鉴别诊断中的应用

《Journal of Biological Engineering》：Application of CRISPR-Cas12a/Cas13a dual enzyme cleavage technology in the differential diagnosis of Chikungunya virus and Dengue virus

CRISPR-Cas12a/Cas13a双酶技术实现CHIKV/DENV快速鉴别诊断，无需昂贵设备，灵敏度达102 copies/mL，临床验证准确率100%。

　　

摘要

基孔肯雅病毒（CHIKV）和登革热病毒（DENV）的感染症状非常相似，但需要不同的管理策略，这凸显了快速、准确的鉴别诊断方法的迫切需求。目前金标准方法——逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）存在显著局限性：它依赖于昂贵的热循环仪、复杂的实验室设施和专业人员，因此在资源有限的环境或现场筛查中难以应用。为了解决这一技术瓶颈，本研究开发了一种基于CRISPR-Cas12a/Cas13a双酶切割系统的便携式、不依赖仪器的快速检测技术。通过精确设计针对CHIKV E1基因和DENV 3′-UTR区域的特异性crRNA，并将其与逆转录重组酶辅助扩增（RT-RAA）技术结合，我们建立了一种能够在等温条件下进行核酸扩增和检测的集成反应系统。该技术的核心机制如下：当识别到相应的病毒靶标时，Cas12a（针对CHIKV）和Cas13a（针对DENV）被激活并切割荧光报告分子或侧向流动条报告探针，从而实现可视化检测。梯度稀释的病毒核酸测试表明，能够产生信号的最低可检测浓度为102拷贝/mL，这与qPCR的结果相当。临床模拟样本验证显示，该系统与qPCR的结果完全一致（100%一致），并且能够准确区分单一感染和共感染。本研究建立的CRISPR双酶切割技术有效规避了qPCR对先进设备的依赖，提供了一种快速、简单且低成本的CHIKV/DENV鉴别诊断方法。这对早期预防和控制虫媒病毒疾病具有重要的实际价值。