《Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis》：Effect of p53 gene mutation with loss of function on the expression of genes and proteins involved in cell proliferation
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CRISPR/Cas9敲除TP53基因导致HT1080细胞中细胞周期调控蛋白和肿瘤相关蛋白显著下降，结构建模显示蛋白结构改变，β-gal活性升高提示衰老，为靶向p53治疗提供依据。
Gyeong Hee Kim | Moon-Moo Kim
应用化学、食品科学与技术系，东义大学，韩国釜山47340
摘要
肿瘤抑制基因TP53通过调节细胞周期进程、DNA修复机制和细胞凋亡，在维持基因组完整性方面发挥着至关重要的作用。本研究旨在探讨CRISPR/Cas9诱导的p53基因功能丧失突变如何影响HT1080人类纤维肉瘤细胞的细胞周期调节和致癌信号传导过程。通过Sanger测序证实了TP53基因的破坏，而使用AlphaFold2和ChimeraX进行的结构建模显示，与野生型相比，预测的TP53蛋白结构发生了变化。通过RT-PCR和qPCR进行的基因表达分析表明，修饰后的细胞中TP53 mRNA的表达显著下降。尽管发生了突变，但编辑后的细胞中衰老标志物β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）的活性却升高了。这些变化表明，CRISPR/Cas9引起的结构破坏导致了TP53功能性的丧失。Western blotting和免疫荧光实验进一步显示，与野生型相比，编辑后的细胞中关键的细胞周期和致癌相关蛋白（包括TP53、磷酸化TP53（p-TP53）、乙酰化TP53（ac-TP53）、MMP-2、cyclin D、cyclin E、AKT、BAX和磷酸化Rb（p-Rb）的表达显著下调。我们的结果表明，TP53突变可能会破坏与细胞增殖和应激反应相关的关键通路。这为理解TP53的功能提供了新的见解，并强调了其在癌症生物学中作为治疗靶点的潜力。
引言
癌症是一种复杂且异质性强的疾病，会影响多个器官，全球每年导致约一千万人死亡[1]。癌症的一个特征是细胞不受控制地生长，并伴有异常细胞的广泛扩散[2]。肿瘤的发展会破坏正常的细胞过程，导致细胞生长失控、逃避生长抑制信号、对程序性细胞死亡的抵抗以及获得转移能力[3]。在这个复杂的网络中，p53肿瘤抑制基因起着关键作用[4]。p53的活性可由多种细胞应激因素触发，包括DNA损伤、缺氧和致癌信号传导[5]。p53通过阻止细胞周期进程、促进DNA修复或在不可逆损伤的情况下诱导细胞凋亡来决定细胞的命运[6]。
在肿瘤学领域，恢复p53的功能已被认为是一种潜在的治疗途径[7]。TP53突变是多种癌症中最常见的基因改变之一，与多种癌症（包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌和肝胆癌）的不良临床结果密切相关[8]。了解调节恶性细胞细胞周期调控的分子机制对于开发更有效的治疗策略至关重要[9]。最近的研究集中在靶向MDMX-p53相互作用以抑制肿瘤的发展和进展并改善临床结果[10]。在这些机制中，MDM2通过直接与p53结合，促进其泛素化并通过蛋白酶体途径进行降解，从而在细胞核和细胞质中促进p53的降解，降低其转录活性并增强其核输出，从而有效抑制p53的肿瘤抑制功能[11]。
p53因其能够通过诱导介导细胞周期停滞的基因的活性来调节G1检查点而广受认可[12]。为了在MDM2抑制的肿瘤中恢复p53的活性，最近开发了一种新型抗癌肽，该肽能够靶向MDM2，有效重新激活p53并防止肿瘤进展[13]。此外，包括Cyclin E、K-Ras和Myc在内的致癌蛋白的致癌激活会抑制p53和视网膜母细胞瘤（Rb）蛋白等关键肿瘤抑制因子的活性，进一步促进细胞的无控制增殖[14]。当负责响应DNA损伤的细胞通路（DDR）受损时，尤其是由于p53、ATM和其他相关成分的基因改变和失调时，会导致遗传不稳定。此外，像Myc和CDK2这样的致癌基因与Cyclin E的异常激活，以及检查点控制蛋白（如ATR-CHK1）的功能丧失，会破坏转录调控，导致复制压力。
这些改变会引发转录-复制冲突，进一步加剧基因组不稳定并促进肿瘤进展[15]。虽然野生型p53在突变形式下仍保留部分功能，但通过MDM2/MDM4抑制剂靶向p53的降解途径提供了有希望的治疗策略，特别是在那些TP53突变率较高或MDM2/MDM4过度表达的肿瘤中[16]。鉴于p53在控制肿瘤细胞生长中的关键作用，迫切需要开发能够直接或间接恢复其肿瘤抑制功能的治疗干预措施。然而，尽管取得了显著进展，CRISPR/Cas9介导的TP53删除对基因表达谱和细胞周期调节的具体影响仍不甚清楚。因此，进一步研究靶向p53丢失的分子和细胞后果对于深入理解p53在癌症生物学中的功能意义以及设计更有效的治疗方法至关重要。
本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立了TP53突变细胞系，以研究p53在细胞周期调节中的作用。CRISPR/Cas9系统通过引导RNA（gRNA）精确靶向基因组区域，该gRNA与protospacer相邻基序（PAM，5'-NGG-3'）相邻的序列结合[17]。设计了一种20个核苷酸长的gRNA，专门针对TP53基因进行靶向。已知HT1080人类纤维肉瘤细胞具有强烈的致癌潜能和编辑前的完整p53信号传导，成功将其转染以创建TP53突变克隆。然后使用这些缺乏p53的HT1080细胞来研究TP53丢失的功能后果，重点关注细胞周期进程的变化、衰老表型和致癌信号通路的变化。
部分内容片段
化学品
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、胰蛋白酶-EDTA以及含有青霉素、链霉素和两性霉素（分别为10,000 U/mL、10,000 μg/mL和2500 μg/mL）的抗生素混合物，以及胎牛血清（FBS）均购自Gibco BRL（英国佩斯利）。HT1080人类纤维肉瘤细胞系购自美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物收藏中心（ATCC）。MTT试剂、琼脂糖和经过DEPC处理的脱脂牛奶均来自相同供应商。
pX459-p53 sgRNA载体系统的构建
pX459载体含有p53 sgRNA，经过修改后能够在p53基因的一个外显子内实现靶向删除。这种包含p53 sgRNA的修改后的pX459载体随后被引入HT1080细胞中。pX459构建体具有双BsbI限制性位点，指定了p53 sgRNA的靶向区域，Sanger测序比对的结果证实了pX459质粒载体的准确组装。
讨论
本研究使用CRISPR/Cas9系统敲除了HT1080细胞中的p53基因，旨在探索其对细胞周期调节的影响及其在癌症治疗中的潜在意义。敲除导致TP53在mRNA和蛋白质水平上的完全丢失，进而引起细胞周期进程的显著变化、衰老的诱导以及细胞外基质的重塑。癌细胞的失控增殖源于...
伦理声明
本研究未涉及人类参与者或动物实验对象，因此无需机构伦理委员会的批准。
资助
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF，编号RS-2017-NR027943）和韩国教育部的基础科学研究计划的支持。
CRediT作者贡献声明
Moon-Moo Kim：撰写 – 审稿与编辑、验证、软件使用、方法论、数据管理、概念构思。
Gyeong Hee Kim：撰写 – 原始草稿、数据可视化、验证、方法论、数据管理、概念构思。
