用于无基质质谱成像的肽特异性纳米探针，可检测细胞或组织上多重蛋白质及其分布情况

《Nano Today》：Peptide-specific nanoprobes for matrix-free mass spectrometric imaging of multiplexed proteins and their distributions on cells or tissues

本研究设计了一种简化的“一锅”合成法制备多肽特异性金纳米探针，结合基质-free激光解吸电离质谱成像（LDI-MSI）策略，实现了对细胞或组织中多种蛋白质的快速、特异性原位多重检测。该方法通过探针与目标蛋白的相互作用放大信号，并利用不同肽标记的探针区分质谱信号，显著提高了分辨率和灵敏度，在四个癌症细胞系及药物抑制实验中验证了其有效性，为肿瘤精准诊断提供了新工具。

　　

Jiahui Sun|Nan Feng|Si Zhang|Mengchen Wang|Huangxian Ju

生命科学分析化学国家重点实验室，南京大学化学与化学工程学院，南京210023，中国

摘要

原位检测多重蛋白质受到靶向识别和操作过程的极大限制。在这里，我们设计了一种一锅法来合成几种肽特异性纳米探针（NPs），以快速识别目标蛋白质分子，并提出了一种无基质激光解吸/电离质谱成像（LDI-MSI）策略，用于在细胞或组织上简单地进行多重蛋白质的原位成像，并放大信号。与传统的柠檬酸合成和后修饰的金纳米颗粒不同，所得到的NPs具有制备简单、高分辨率和低背景的特点，同时具有可控的无基质和亲离子性质。这些NPs已被用于方便且灵敏地检测四种癌细胞系上三种特定蛋白质的相对表达，并有效评估不同药物对这些蛋白质的抑制作用。所提出的MSI方法通过多重蛋白质分布的变化，能够清晰地区分肿瘤组织的不同病理区域，显示出其在临床疾病诊断和精准医疗中的巨大潜力。

引言

蛋白质在生物体中在信号传导、结构支持和催化作用中起着重要作用[1]，因此它们的原位和多重检测可以为各种生物和生物医学研究提供关键信息[2]。为了提供蛋白质分子的空间信息[3]，已经开发了多种成像策略来原位检测细胞和组织上的多重蛋白质[4]、[5]。其中，荧光成像已成为原位可视化多重蛋白质的通用方法[6]。为了实现蛋白质的高通量检测，提出了一种循环迭代间接免疫荧光成像方法，通过在每个循环后去除荧光信号来避免光谱重叠[7]，但这种方法存在表位丢失、重复过程中组织降解以及荧光团未完全失活的问题[8]。为了克服这些缺点，迫切需要开发简单快速的原位检测和多重蛋白质高通量成像分析策略。

质谱（MS）在多重蛋白质的分析应用中具有吸引人和明显的优势，因为它具有高通量和高灵敏度[9]。它使用m/z作为信号，提供了高分辨率，并可以避免信号串扰。此外，MS成像（MSI）能够在同一实验中同步分析各种目标的空间分布[10]。特别是，基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI-MS）由于其方便的生物组织样本制备和耐盐性[11]、[12]、[13]，已被广泛用于多重生物标志物的鉴定和检测。迄今为止，MALDI-MS对蛋白质的分析几乎依赖于它们的酶促消化和肽段的检测[14]、[15]，或者直接在广泛的m/z范围内对蛋白质进行原位电离[16]、[17]。前者仅适用于具有肽水解活性的有限蛋白质，而后者则受到固有低电离效率的限制。使用纳米探针和同位素作为质量标签进行特异性标记，大大扩展了MS的检测范围[18]、[19]、[20]。此外，过去十年中，具有大表面积的纳米材料在激光解吸/电离质谱（LDI-MS）中用于生物标志物的鉴定和检测方面表现出明显的优越性[21]、[22]。一些碳纳米材料，如单壁碳纳米角，具有丰富的内部纳米空间和高度缺陷的角结构，为分析物的解吸和电离提供了高能量传递效率[23]。值得注意的是，使用纳米材料代替传统的有机酸基质可以改善MALDI-MS的固有缺陷，例如强烈的背景噪声干扰和由于分析物与基质异质共结晶导致的重复性不足[24]。例如，Bai等人使用双功能切割探针实现了细胞或组织上多重糖类的原位质谱检测和成像[25]。然而，一些问题，如凝集素的多步修饰和质量标签的位阻，以及单个质量标签产生的多个质量峰，极大地限制了它们的应用。因此，开发同时具有多重蛋白质特异性识别和高效LDI-MS基质功能的纳米探针至关重要。

在这里，我们设计了一种一锅法，通过功能肽（FPs）中的酪氨酸的酚羟基还原AuCl₄^-，以及NPs与肽和和质量标签（MTs）中的巯基之间的相互作用（图1a），方便地合成肽特异性金纳米探针（NPs）。NPs上的FPs可以快速识别细胞或组织上的目标蛋白质，从而利用不同的特定肽和MTs合成NPs，实现多重蛋白质的简单原位 MSI（图1b）。与传统的柠檬酸合成和后修饰的金纳米颗粒相比，所提出的金NPs具有可控的无基质和亲离子性质。因此，NPs使得LDI-MS分析具有低背景，而MTs确保了质量峰的精确区分。此外，加载更多的MTs而不是FPs可以放大信号，从而更灵敏地检测目标蛋白质。作为强大能力的证明，所设计的NPs和提出的MSI方法被应用于同时原位检测细胞或组织上的NRP-1、EGFR和α_vβ₃，并监测外部刺激下多重蛋白质的相对表达变化，能够清晰地区分肿瘤组织的不同病理区域，显示出其在临床疾病诊断和精准医疗中的潜在应用。纳米探针的创新设计避免了复杂的修饰和质量标签之间的串扰，大大提高了检测灵敏度，从而清晰地区分不同的病理区域。简化的操作程序也有助于提高LDI-MSI的临床实用性。

部分摘录

使用LDI-MS验证NPs的性能

针对NRP-1、EGFR和α_vβ₃的NPs分别使用AuCl₄^-和相应的FPs（表S1）及MTs（HS-PEG₈-CH₂CH₂COOH、HS-PEG₂-CH₂CH₂COOH、HS-PEG₄-CH₂CH₂COOH）混合物合成。-COOH的存在确保了NPs的亲水性，提高了它们对生物膜的亲和力，从而快速识别细胞或组织上的蛋白质。在激光照射下金纳米颗粒吸收能量后，金

结论

本研究设计了一种简单的一锅法，方便地合成含有MTs的肽特异性NPs，用于快速且特异性地识别目标蛋白质，从而实现细胞或组织上多重蛋白质的原位 MS成像。这些NPs表现出无基质和亲离子性质，以及良好的单分散性，并在多重LDI-MS分析中显示出低背景、分离的质量峰和放大的信号。

CRediT作者贡献声明

Mengchen Wang：软件，形式分析。Nan Feng：监督，形式分析，概念化。Si Zhang：研究，形式分析。Jiahui Sun：撰写——原始草稿，验证，形式分析，数据管理，概念化。Huangxian Ju：撰写——审稿与编辑，监督，方法学，资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（21890741）和江苏省前沿技术研发计划（BF2024055）的财政支持。

支持信息

与本文相关的补充数据可以在在线版本找到：https://doi.org/10.1016/j.nantod。

Jiahui Sun正在南京大学攻读分析化学博士学位。她的研究兴趣包括使用功能性质量纳米探针进行多重生物标志物的检测和成像。