《Plant Cell Reports》：Transgene-free genome editing in citrus and poplar meristem tissues via biolistic ribonucleoprotein delivery of CRISPR-Cas9
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本研究旨在解决传统组织培养方法难以转化、难以获得无外源转基因植物的多年生木本植物的基因组编辑难题。研究人员采用基因枪介导的粒子轰击法，将CRISPR-Cas9 RNP（核糖核蛋白复合体）直接递送至柑橘茎尖分生组织(SAM)和杨树腋生分生组织(AXM)中，成功在CsNPR3和Pt4CL1基因位点产生了定向突变，并获得了嵌合体编辑植株。该工作建立了一种可行的、创新的无外源转基因植物生产框架，为林木育种提供了新策略。
基因组编辑技术，特别是CRISPR/Cas9系统，为植物遗传改良带来了革命性的潜力。然而，对于多年生木本植物，尤其是那些对常规组织培养不敏感或再生的物种，如何高效、无外源基因地实现基因组编辑，一直是科研人员面临的重大挑战。传统的基于DNA载体的转化方法不仅效率低下，还会将外源基因（即转基因）整合到植物基因组中，这可能引发公众担忧并给后续的监管审批与商业化应用带来障碍。因此，开发一种能够绕开组织培养、直接对植物细胞进行编辑且不遗留外源DNA的技术，对于林木等多年生植物的遗传改良具有迫切需求。
研究者们将目光投向了植物体内一群特殊的“干细胞”——分生组织。这些组织位于植物的茎尖或叶腋等处，由具有全能性、高度再生能力的细胞组成，是植物持续生长和新器官形成的源泉。针对这些细胞的编辑，有望将突变直接传递给整个植株甚至下一代。本研究发表在《Plant Cell Reports》上，探索了利用基因枪法（又称粒子轰击法）将基因组编辑试剂直接递送至分生组织的可能性，并以柑橘和杨树这两种具有重要经济价值但传统遗传转化困难的木本植物为研究对象，旨在建立一套无外源转基因（transgene-free）的基因组编辑新体系。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键方法：首先，以基因枪（biolistic particle bombardment）技术作为递送手段。其次，递送的编辑试剂主要为CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合体（RNP），并与基于DNA质粒的递送方式进行对比。第三，实验选用柑橘成熟种子的茎尖分生组织（SAM）和杨树离体培养枝条的腋生分生组织（AXM）作为受体材料。最后，通过测序技术（包括桑格测序和高通量测序）和体外切割实验来评估编辑效率和靶点活性。
研究结果与发现
1. 基于GFP载体验证基因枪转化效率
研究人员首先使用一个表达绿色荧光蛋白（GFP）的质粒载体（pYPQ131-eGFP）来验证和优化粒子轰击参数。通过检测荧光信号（），并结合PCR及桑格测序验证，他们发现柑橘分生组织获得了极高的平均转化效率（87.9%），杨树的平均效率为13%。这证明了基因枪法能够成功地将外源DNA导入目标分生组织细胞。
2. 基于DNA质粒的基因组编辑尝试失败
随后，研究团队改用包含CRISPR/Cas9编辑元件的DNA质粒载体（pLR5468和pLR5469）进行转化，靶向柑橘的CsPDS和CsNPR3基因。虽然获得了转基因植株，但未观察到CsPDS基因敲除后预期的白化表型。通过下一代测序（NGS）分析CsNPR3基因，也未检测到任何突变。这表明基于DNA质粒的递送可能因载体大小、DNA片段化或不稳定等原因，未能有效地将功能完整的编辑系统递送到细胞中。
3. 转向RNP递送实现无外源转基因编辑
鉴于DNA递送的局限性，研究转向了CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体（RNP）的递送。RNP是预先在体外组装好的Cas9蛋白和指导RNA的复合物，具有瞬时作用、无需DNA整合的优势，是实现无外源转基因编辑的理想选择。
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对于柑橘，研究人员设计了靶向CsNPR3和CsPDS基因的sgRNA（单向导RNA），并通过体外切割实验验证了其活性（）。然后将纯化的Cas9蛋白与sgRNA混合形成RNP，通过基因枪递送到柑橘茎尖分生组织。
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实验结果显示，通过RNP递送成功在CsNPR3位点获得了编辑植株，尽管这些植株是嵌合体（即只有部分细胞被编辑）。对叶片的混合样本和单叶样本进行测序分析，鉴定出T或A单核苷酸插入的突变，最高编辑效率达到4.95%。这证明了RNP递送能够产生可遗传的突变。
4. 在杨树中成功应用RNP编辑
类似地，研究人员在杨树中应用了相同的策略，靶向Pt4CL1基因。体外切割实验显示靶向Pt4CL1的sgRNA活性良好。通过基因枪将相应的RNP递送至杨树腋生分生组织后，成功获得了六个嵌合编辑植株，这些植株在切割位点同样存在单核苷酸插入或缺失，其中一株的编辑效率超过1%。这表明该技术方法同样适用于杨树等其他木本物种。
结论与重要意义
本研究通过创新的递送策略，成功地将CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合体（RNP）直接导入柑橘和杨树的分生组织，首次实现了在这两种木本植物中通过非DNA递送方式获得无外源转基因的基因组编辑植株。尽管目前得到的编辑植株多为嵌合体，编辑效率有待提高，但这项研究证明了其概念上的可行性。该方法的成功具有重要意义：
首先，它提供了一种克服木本植物组织培养和再生障碍的新途径。其次，RNP递送避免了外源DNA的整合，所得编辑植株不含有转基因，这极大地简化了未来监管审批流程，有利于相关品种的商业化推广。最后，该研究建立了一个通用性框架，有潜力推广到其他遗传转化困难的多年生作物或林木中。正如作者所指出的，通过后续的不断剪枝、筛选等传统园艺手段，有望从这些嵌合体中获得稳定遗传的纯合突变株系，从而为林木的精准育种和性状改良开辟了一条充满希望的道路。
