《Environmental DNA》：Investigating Environmental DNA Variability and Species Detections Through Passive and Active Sampling Across Time: A Case Study From a Hyper-Diverse Coastal System
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本文通过比对环境DNA (eDNA) 元条形码 (metabarcoding) 技术中主动 (使用Sterivex过滤) 与被动 (使用填充纱布的探针) 采样方法，研究了南非海藻林生态系统中鱼类与无脊椎动物的生物多样性。研究表明，两种方法在检测不同类群（鱼类 vs. 后生动物）时性能各异，eDNA信号存在显著时空变异性，并强调在实施eDNA生物监测前，需根据区域特性和研究目标进行细致的项目规划和优化。
1 引言
生物多样性保护对于生态系统在气候变化下的存续至关重要。南非海洋环境具有高度的生物多样性和特有性，但物种分布模式通常未被充分了解。环境DNA (eDNA) 元条形码技术是一项有望填补生物多样性信息缺口的有力工具。然而，前期研究表明，即使在微小的时空尺度上（< 300米，24小时内），eDNA信号也存在高度变异性。被动采样器通过在一段时间内积累DNA，可能有助于克服eDNA高变异性的挑战。本研究利用多种分子标记（线粒体12S核糖体RNA，mtDNA 12S rRNA；线粒体细胞色素c氧化酶亚基I，mtDNA COI），在检测海藻林相关生物多样性（重点关注鱼类和无脊椎动物）方面，测试了主动（使用Sterivex）和被动（纱布填充探针）采样方法。实验在不同时间段（6、12、24小时）进行，并假设24小时的探针将获得最丰富的物种多样性。研究发现，针对不同类群和标记，两种方法的检测能力各有优劣，这突显了在将eDNA元条形码作为生物监测工具实施前，需要采用针对特定区域的方法并进行谨慎的项目规划。
2 材料与方法
2.1 采样
研究于2024年11月12日至13日在南非默多克山谷附近的海藻林进行。研究比较了主动（水样过滤）和被动（“探针”收集）eDNA采样方法。共部署了15个被动样本（探针）和12个主动样本（水样），覆盖了四个时间点。主动样本是在部署探针时即刻采集水样并过滤；而被动样本则是在6、12和24小时后回收探针，收集其中积累的DNA。
2.2 DNA提取与测序
所有DNA提取均在专门用于eDNA工作的超净实验室内进行。主动样本采用经修改的Czachur等(2022)协议进行DNA提取。被动样本则从棉纱布包上剪取约3 cm2样品进行提取。提取后的DNA由瑞士SimplexDNA公司进行文库制备、测序和生物信息学分析。
2.3 图形摘要与统计分析
研究使用多种统计方法分析数据，包括生成每个样本的读取数和精确序列变体 (ESVs) 的散点图，计算平均值和标准差，并进行ANOVA或Kruskal-Wallis检验。通过条形图探索采样时间如何影响群落多样性图像，并利用非度量多维尺度分析 (NMMDS) 和永久性方差分析 (permanova) 来检验主动与被动方法在描述群落特征上的差异。所有分析均在R环境中使用vegan、ggplot2、eulerr和indicspecies等软件包完成。
3 结果
3.1 每种采样方法的ESVs和读取数
经过所有过滤步骤后，在MiFish 12S数据集中共检测到33个独特的ESVs，归属于18个不同的鱼类科（16个属和9个种）；在COI数据集中检测到1481个ESVs，归属于17个不同的门（45个纲，97个目，99个科，88个属和55个种）。对于MiFish 12S数据集，主动采样检测到了31个ESVs（94%），而被动采样检测到了21个（64%），且主动采样的平均值也显著高于被动采样（p < 0.001）。在COI数据集中，被动采样检测到了1212个ESVs（82%），主动采样检测到了988个（67%），但主动采样的平均值显著高于被动采样（p < 0.001）。在所有情况下，被动样本在读取数和ESVs数量上都具有更高的变异性。
对于被动采样，ESVs和读取数的积累模式因使用的标记物而异。在MiFish 12S数据集中，未观察到读取数与检索到的ESVs数量之间存在关系，且趋势不随时间变化，表明MiFish 12S扩增读取没有积累证据。相比之下，COI数据集在读取数和ESVs数量之间存在显著关系，尽管存在相当大的变异，但总体趋势表明随时间推移有积累效应。
3.2 不同方法与不同时间间的群落差异
使用MiFish引物，eDNA元条形码检测到了一系列系统发育多样化的鱼类，但以Clupeidae和Dussumieriidae这两个包含小型中上层类群的科为主。主动采样检测到了全部18个科，而被动采样检测到了14个。COI数据集在检测鱼类方面与MiFish数据存在差异：尽管COI检测到了更多归属于鱼类纲的ESVs，但只检索到了7个科。两个引物组共同检测到了Clinidae、Clupeidae和Gobiesocidae等科。仅由COI检测到的额外科包括Batrachoididae、Tripterygiidae、Dasyatidae和Scyliorhinidae，后两者为软骨鱼类。对于COI数据集，读取数最高的门包括Mollusca（软体动物）、Annelida（环节动物）和Cnidaria（刺胞动物）。在总共17个门中，主动方法检索到15个，被动方法检索到全部。
在所有比较主动与被动方法在描述鱼类和后生动物群落特征上的永久性方差分析测试中，结果均显示显著差异。主动方法在检索海藻林中存在的科/门方面比被动方法更一致，但被动方法检索到了额外的类群。
4 讨论
4.1 主动与被动采样器检索到不同的群落
研究结果表明，主动样本在所有统计指标（读取数、ESVs和检索到的类群的变异）上更为一致，其变异小于被动重复样本。结果总体表明，主动方法在描述目标海藻林的鱼类群落方面表现更好；但被动方法（尽管变异性更大）能够检测到后生动物群落的额外类群。此外，仅在COI数据集而非MiFish数据集中观察到了被动样本中读取数和ESVs的预期积累趋势。这些发现表明，采样方法和引物都会影响不同类群的检测。
部署方法是影响eDNA捕获和下流多样性检测的一个方面。海藻林冠层会减弱水流，特别是在本研究部署探针的春季低潮期间，因此探针在流动水域中或放置在流速较高的区域时，其性能可能会显著提升。此外，所用材料的孔径大小（Sterivex- 0.22 μm；纱布- 100–500 μm）和扩增DNA片段的大小（12S：160–190 bp；COI：303–323）也可能是影响因素。在被动采样中，水流特性、孔径大小、DNA结合亲和力以及目标标记物都可能影响材料的性能。因此，在本研究的背景下，当采样器在水中静止时，玻璃纤维过滤器或活性炭等其他材料可能是比纱布填充探针更合适的选择。
4.2 被动采样器并未随时间持续积累多样性
尽管存在变异性，研究者假设浸没时间最长（24小时）的被动采样器会比浸没时间较短（6、12小时）的采样器积累更多的DNA和来自更多样来源的DNA。然而，本研究中部署24小时被动采样器的结果并未支持这一预期，因为无论是被动还是主动方法，群落组成均未按采样时间聚类。但研究者确实在COI引物（而非MiFish数据集）的探针中观察到了ESVs和读取数积累的总体趋势。这突显了采样方法和引物都会影响不同类群的检测。有趣的是，不同系统和研究中被动采样的时间差异很大，从几分钟到几天不等，因此在决定被动采样器的浸没时间时，必须考虑区域背景。
在物种丰富的沿海系统（如南非的海藻林）中，海洋群落（包括稀有物种）的检测很可能取决于水中eDNA的浓度及其在一天中的变化，因此需要能够应对这些变化的采样方法。总体而言，本研究为使用被动采样器检测海洋生物多样性提供了引人深思的见解，并进一步强调了eDNA采样设计和工作流程取决于具体的环境和研究目标。最终，前瞻性的eDNA项目的成功和有效性将受益于试点试验，以帮助确定最佳实践，从而扩大eDNA调查的获取途径和适用性，以更好地支持水生系统及其资源的保护和管理。
