1 Introduction
自然杂交现象在植物、动物和真菌中广泛存在，可导致多种结果，其中杂交区的形成和基因渐渗（introgression）被广泛认知。然而，同倍体杂交物种形成（homoploid hybrid speciation， HHS）——即不伴随全基因组重复（whole-genome duplication）的杂交形成新物种——的普遍性和进化意义仍存在积极争论。其部分原因在于，调控该过程的机制及其影响因素之间的相互作用复杂且仅被部分理解。
生态学在杂交中的作用有多种方式。它可以作为杂交的障碍，也可以创造机会，使生态选择过滤掉杂交产生的遗传变异。在同倍体杂交物种形成中，内部合子后屏障（如染色体重排和基因不育）为通过重组物种形成（recombinational speciation）实现生殖隔离提供了机制。然而，实证研究表明，生态分化对于成功的同倍体杂交物种形成至关重要。几乎所有已记录的二倍体杂交物种都表现出与其亲本物种显著的生态分化。生态分化使杂交种能够占据不同于其亲本物种的生态位（niche），从而减少基因流并促进杂交谱系的稳定。
除了生态方面，杂交分化和物种形成通常还与相对于亲本物种的地理位移有关。这已在实证和模拟研究中得到报告和综述。例如，鸟类杂交物种Passer italiae占据与其亲本物种相似的生态位，但基因流的物理障碍使其能够在隔离中分化。
Phalacrocarpum (DC.) Willk. 是伊比利亚半岛特有的二倍体被子植物属，分布于其西北象限的一系列山脉。该属不稳定的分类学归因于杂交，最初基于叶片形态，后来由分子标记证实。Flora Iberica中承认了一个物种Phalacrocarpum oppositifolium，包含三个亚种：subsp. anomalum, subsp. oppositifolium, 和 subsp. hoffmannseggii。
然而，我们最近基于核和质体DNA系统基因组学证据的研究，在Phalacrocarpum中识别出七个遗传组和一个杂交区。该研究还揭示了可能交替发生的杂交事件和促进观察到的遗传分化的隔离阶段。具体而言，我们推断出（1）近期杂交，导致Sanabria Valley目前不活跃的杂交区；（2）西部subsp. anomalum种群中的反复基因渐渗；（3）葡萄牙中部和南加利西亚-北葡萄牙地区的非近期杂交事件，分别导致了subsp. oppositifolium和加利西亚-葡萄牙边境组（GP）的同倍体杂交物种形成过程；（4）坎塔布连山脉subsp. anomalum种群显著的遗传分化，但没有明显的表型分化。Phalacrocarpum的起源时间估计使其成为研究生态和地理因素如何在气候驱动的更新世分布范围变化背景下影响杂交和多样化的合适属。
本研究中，我们利用生物气候物种分布模型（SDM）估算了Phalacrocarpum内所有基于遗传的分类组的气候耐受性，并预测了它们在当前和过去气候条件下的潜在分布。我们还通过进行多变量分析以及生态位等效性和相似性检验，研究了这些组之间的气候生态位分化。总体目标是评估气候分化和过去分布范围动态在塑造Phalacrocarpum多样化中的相对作用，包括它们在我们先前系统基因组学研究中推断的同倍体杂交物种形成（HHS）和反复杂交案例中的作用。
2 Materials and Methods
2.1 Distribution Data and Plant Material
我们从全球生物多样性信息机构（GBIF）、多个植物标本馆以及我们自己地理参考的采样点收集了Phalacrocarpum属的分布数据。所有数据库都经过地理精度过滤，仅保留坐标记录到至少两位小数的出现点，确保精度约为1 km2。根据我们之前的研究审查了每个样本的分类鉴定，并将每个样本分配给七个遗传组之一。
2.2 Environmental Descriptors
我们使用了WorldClim 2数据库中的生物气候描述符集来描述Phalacrocarpum属及其不同分类组的气候生态位。我们还使用WorldClim 1.4数据库中可用的三组古气候数据估算了这些类群过去的潜在分布：全新世中期（约6000年前）、末次盛冰期（约22000年前）和末次间冰期晚期（约12万-14万年前）。
2.3 Species Distribution Modelling
我们使用R包sabinaNSDM为Phalacrocarpum内的所有分类组校准了物种分布模型（SDM）。我们为每个分类组构建了9个集成模型组合，总共54个模型。模型性能使用AUC、TSS、Kappa和Boyce指数进行评估，最终模型选择基于中位数排名系统。最终模型被投影到当前和过去的气候情景下，并基于ROC阈值生成二值模型以识别遗传组之间的重叠区域。然后使用Jaccard相似性指数量化每个气候情景下分类组之间的成对空间重叠。
2.4 Niche Study
为了分析样本的环境分布，我们使用为Phalacrocarpum全局模型选择的不相关变量进行了PCA。为了估计生态位差异，我们遵循了Broennimann等人提出的框架，该框架使用PCA成分和核密度函数来定义网格化的环境空间和出现分布。使用Schoener's指数（D）测量生态位重叠，范围从0（无重叠）到1（完全重叠）。使用ecospat R包实施生态位等效性和相似性检验。
3 Results
3.1 Current and Past Potential Distribution of Phalacrocarpum
为Phalacrocarpum分类组开发的54个集成模型显示出高可靠性（AUC > 0.9）。选择了六个表现最佳的模型进行详细分析。不同时期模型预测揭示了潜在分布的显著变化。
3.1.1 Current Potential Distribution
当前选定集成模型的预测与每个分类组的已知地理分布一致。P. oppositifolium subsp. anomalum的三个组形成了一个几乎连续的分布范围。subsp. hoffmannseggii (HOF)的适宜区域超出了其当前已知分布范围。subsp. oppositifolium (OPP)的适宜区域预测在其当前已知分布区，但也出现在其以北的区域。在加利西亚-葡萄牙边境组（GP）的当前已知分布区内，OPP的适宜区域与该组的预测适宜区域大部分重合。
3.1.2 Temporal Dynamics Across Periods
跨时期来看，模型预测显示了潜在分布的显著变化。与当前预测相比，末次间冰期预测显示大多数组的潜在分布更广。在末次盛冰期期间，适宜区域向低海拔和沿海地区转移，大多数组显著扩张。到全新世中期，除subsp. hoffmannseggii (HOF)外，所有组的适宜区域普遍收缩。
适宜区域的重叠在不同时期变化显著。在末次间冰期，观察到subsp. anomalum的中部（CA）和西部（WA）组之间以及WA和subsp. hoffmannseggii (HOF)之间的重叠最高。在末次盛冰期，空间重叠总体增加，WA–HOF和subsp. oppositifolium (OPP)–GP之间观察到最高值。在全新世中期，重叠普遍减少，但CA–WA、WA–HOF和OPP–GP之间仍然显著。在所有时期，subsp. anomalum的东部组（EA）始终保持一致的空间隔离。
3.1.3 Integrated Spatial Patterns and Refugial Structure
综合预测确定了长期气候适宜性持续存在的区域（解释为潜在避难所），以及过去专属避难所（即在至少两个连续过去时期保持适宜但当前不再维持有利条件的区域）。长期和过去专属避难所主要集中在subsp. anomalum西部组（WA）和subsp. hoffmannseggii (HOF)的Montes de León和南加利西亚-北葡萄牙山脉之间。subsp. anomalum中部组（CA）在坎塔布连山脉中段沿线展现出广泛的长期避难所，与其当前气候适宜区域重合。相比之下，EA组本身缺乏持久和过去专属避难所，在不同时期始终保持空间隔离。subsp. oppositifolium (OPP)的长期避难所主要限制在其在葡萄牙中部山脉的当前分布区，以及南加利西亚-北葡萄牙山脉。同时，GP仅在其当前出现地显示长期避难所，没有过去专属避难所的证据。
3.2 Niche Overlap and Equivalency/Similarity Test
基于所有分类组出现点的PCA中，前两个主成分解释了总方差的86%。散点图允许基于PC2识别三个组。成对生态位比较揭示了分类组之间气候生态位分化的明确证据。生态位等效性检验对所有组对均显著，表明大多数组占据不同的环境空间。生态位相似性检验显示，尽管有独立的进化轨迹，EA–HOF和GP–OPP比较表现出保守的气候生态位。
Schoener's D值证实了这些结果，检测到最高的气候生态位重叠在东部subsp. anomalum组（EA）和subsp. hoffmannseggii (HOF)之间，其次是加利西亚-葡萄牙组（GP）和subsp. oppositifolium (OPP)对，以及subsp. anomalum的中部（CA）-西部（WA）组之间。所有其他比较的D值均低于0.13，反映了有限的气候生态位共享。
4 Discussion
整合生物气候SDM和生态位分析与系统发育和系统地理数据提供了一个可以检验关于影响谱系多样化的历史和生态过程假设的框架，并最终有助于更好地理解复杂的进化情景。我们的研究旨在调查Phalacrocarpum属中识别出的网状进化情景如何与从SDM和气候生态位分析推断的当前和过去地理范围估计相一致，并评估气候生态位分化的可能作用。
4.1 Ecological and Geographical Divergence in Phalacrocarpum
Phalacrocarpum分布在伊比利亚半岛两个主要宏观生物气候（温带和地中海）边界附近的山脉中，可能为其多样化提供了环境机会。具体而言，该属最早推断的分化——介于P. oppositifolium subsp. anomalum和subsp. hoffmannseggii之间——可能是由这两个谱系之间的生态（气候生态位）分化驱动的。在山区植物系统中，生态分化是物种形成的一个合理驱动因素，特别是当几个因素汇聚时，例如有限的扩散能力、狭窄的生态耐受性以及具有复杂地形和岩性的异质景观。这些条件可以促进暴露于不同选择压力的空间结构化种群，即使在存在基因流的情况下也能促进谱系分化——即subsp. anomalum和subsp. hoffmannseggii的早期分化。
然而，气候生态位差异不太可能是唯一的隔离机制，因为有证据表明地理因素也起了作用。尽管等效性和相似性检验显示subsp. anomalum（至少对于西部和中部组）和subsp. hoffmannseggii的气候生态位既不等效也不相似，但我们发现了一定程度的气候生态位重叠。与严格的异域物种形成（allopatric speciation）模型或纯粹的同域物种形成（sympatric speciation）模型所预期的不同，我们观察到两个过程都可能做出了贡献的迹象，表明为邻域物种形成（parapatric speciation）。在这个模型中，一个分类群的地理范围延伸到种群间扩散有限的区域，尽管存在持续的迁移，仍能促进和维持不同区域种群之间的遗传变异。此外，在邻域物种形成中，新谱系通常会建立接触区，正如在Phalacrocarpum中Montes de León和Sanabria Valley所记录的那样，这些地区恰好是subsp. hoffmannseggii和subsp. anomalum西部-中部组之间一些最强烈和最持久的适宜区域重叠区。这些接触区在防止完全隔离的同时，仍然使得更远距离的种群能够分化。
地理和气候因素似乎在塑造P. oppositifolium subsp. anomalum内部的分化中都发挥了重要作用，其中东部组（EA）代表一个孑遗组，西部组（WA）是一个过渡性和基因渐渗组，而中部组（CA）是两者的主要来源谱系。等效性和相似性检验揭示了中部（CA）、西部（WA）和东部（EA）组之间的显著差异。CA的预测表明，在当前EA占据的区域，以及在WA出现的西坎塔布连山脉和Montes de León地区，存在长期和过去专属的避难所。相比之下，EA没有稳定避难所的证据，这意味着其小而分散的种群可能代表了以前更广泛的CA分布范围在气候变化条件下破碎化的残余，而不是通过垫脚石过程反复重新定殖的结果。EA和subsp. hoffmannseggii (HOF)之间检测到的部分气候相似性（尽管它们的生态位不等效）更可能是由气候趋同（climatic convergence）来解释的。
相反，WA展现出随时间稳定的避难所，这些避难所与HOF的避难所显著重合，同时与CA也有当代重叠。尽管其气候生态位在统计学上与其他组不同，但WA显示出与CA和HOF相对较高的重叠值。WA在PCA中的位置进一步反映了占据部分与CA共享但逐渐接近HOF典型气候条件的种群。总之，这些模式表明WA种群占据着CA和HOF之间的过渡生态位。因此，该地区的subsp. anomalum种群可能在共享的避难区与HOF经历了反复接触，随后在气候变化的驱动下，在其当前占据的区域经历了反复的范围变化。
4.2 Ecological Divergence and Homoploid Hybrid Speciation in Phalacrocarpum
本研究恢复的生态和地理模式使我们能够评估气候生态位分化在从基因组数据推断的同倍体杂交物种形成事件中的潜在作用。与其他包含同倍体杂交物种的类群一样，我们的结果表明气候生态位分化在Phalacrocarpum中被识别为同倍体杂交谱系的组的分化中也发挥了作用。特别是，P. oppositifolium subsp. oppositifolium（OPP）和加利西亚-葡萄牙边境组（GP）占据了比其余类群降水更高的环境。
对于subsp. oppositifolium (OPP)，其与亲本谱系（subsp. anomalum和subsp. hoffmannseggii）的生态位重叠值（D）接近于零，并且生态位等效性和相似性检验都表明显著的气候生态位分化。这些结果表明，环境因素，包括生物气候和相关的生理差异，在促进subsp. oppositifolium的隔离和分化中发挥了关键作用——可能比地理因素更强。
相比之下，加利西亚-葡萄牙边境组（GP）显示出更复杂的模式。与subsp. oppositifolium (OPP)一样，该组与大多数类群（包括其推断的亲本谱系之一subsp. hoffmannseggii (HOF)）显示出较低的生态位重叠值和显著的检验结果，支持气候生态位分化在其起源中的作用。然而，其与另一个亲本谱系OPP的生态位重叠值相对较高，并显示出不显著的等效性和显著的相似性结果，表明高度的气候生态位保守性，意味着这些组在其当前分布范围内表现出非常相似的气候需求。此外，它们的潜在分布模型显示出重叠的适宜区域，为OPP识别的长期和过去专属避难所包括了GP的当前分布区。总之，这些结果表明，气候因素促进了GP与HOF的分化，而异域分布——地理隔离——可能在杂交后维持了其相对于OPP的独立性。因此，GP种群很可能起源于最北端的OPP种群，这些种群在初次分化后与HOF再次接触。
尽管Phalacrocarpum中这些初期的杂交物种占据了一个或两个亲本类群不同的气候空间，支持了生态（气候生态位）分化是同倍体杂交物种形成过程中促进生殖隔离和谱系稳定的关键过程的假说。我们的发现也强调了环境和空间因素在塑造Phalacrocarpum这一过程中的互补作用，符合Kadereit的论断，即许多同倍体杂交植物物种是通过生态分化和地理位移的结合而产生的。
4.3 Distributional Shifts and Hybridization During the Pleistocene
除了驱动多样化的生态和地理因素外，从基因组数据与SDM收集到的证据表明，反复的杂交和基因渐渗调节了该属的谱系多样化，并随后调节了其多样性。在一个内在生殖隔离不完全的属中（如通过多次人工成功杂交所示），古气候预测揭示了Phalacrocarpum谱系之间接触和隔离的时期，这有助于理解当前多样性是如何形成的。
P. oppositifolium subsp. hoffmannseggii (HOF)显示出与其他组随时间最大的重叠——特别是与subsp. anomalum西部组（WA）——可能在其范围最大的扩张期发生在末次间冰期或具有类似气候条件的更新世时期。至少从这个时期开始，HOF和subsp. anomalum之间的接触区可能在不同时期（冰期和间冰期）都保持相对稳定。这个位于伊比利亚西北部（即Montes de León及邻近地区）的广泛接触区可能作为一个扩散杂交区（diffuse hybrid zone），在不同时期产生了不同的杂交谱系。这些包括两个非近期的subsp. oppositifolium谱系、加利西亚-葡萄牙边境组（GP），以及基因渐渗的WA种群和更近期的Sanabria Valley杂交种群。
核和质体基因组证据表明，两个subsp. oppositifolium (OPP)谱系是独立起源的。最简单的地理情景是subsp. anomalum不同组在葡萄牙山脉（OPP的发现地）过去有广泛的分布，subsp. hoffmannseggii (HOF)可能与之独立杂交。然而，SDM在任何研究情景中均未显示任何subsp. anomalum组或HOF在这些地区有明显的适宜性。因此，两个OPP谱系很可能在Montes de León地区内独立起源（空间上或时间上），随后迁移到它们当前的位置。亲本谱系之间的接触可能至少可以追溯到末次间冰期。然而，到达两个OPP谱系的当前位置——Serra da Freita、Montemuro和Serra da Estrela——只有在寒冷时期（如末次盛冰期）才有可能，当时连接南加利西亚和葡萄牙中北部的低地走廊将促进新杂交谱系向南迁移。更新世反复的冰期-间冰期循环可能塑造了这些路线，促进了生态分化并隔离了不同的OPP谱系。
加利西亚-葡萄牙边境组（GP）通过subsp. oppositifolium (OPP)和subsp. hoffmannseggii (HOF)之间的杂交形成，其形成可能发生在末次盛冰期之后。随着气候在向全新世过渡期间变暖，Phalacrocarpum类群的分布范围收缩并向高海拔转移。这种模式在其他高山-山区生物中以及伊比利亚植物中都有充分记录。在这次向全新世的过渡期间，南部的OPP种群很可能在其当前分布区内变得隔离，而北部的种群则保持接触或与HOF重新接触，导致杂交和GP的出现。
向当前间冰期的过渡导致了该属高度破碎化的分布。对于subsp. hoffmannseggii (HOF)而言，自末次盛冰期以来，其在西部和北部地区的适宜区域减少是显著的，这可能促进了subsp. anomalum东部组（EA）的独立性。对于subsp. anomalum，其西部组（WA）在北部（坎塔布连山脉）和南部（Montes de León）的隔离可能导致了遗传分化和亚种内的多样化，正如之前所推断的那样。对于subsp. oppositifolium (OPP)，在Serra da Estrela（OPP-SE）和Freita-Montemuro（OPP-FM）的种群之间缺乏适宜的走廊，表明它们可能在更新世晚期或全新世早期被隔离。
