《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Sweet cherry rootstock micropropagation using SETIS? bioreactor: evaluation, challenges, and biochemical characterization of regenerated shoots
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本研究针对甜樱桃（Prunus avium）砧木传统半固体培养基微繁殖成本高、效率低的问题，通过对比传统半固体培养基与SETIS?临时浸没生物反应器（TIB）两种培养系统，系统评估了TIB对砧木Gisela 6和P. avium1离体繁殖效率及再生苗生理生化状态的影响。结果表明，TIB系统能显著促进芽的伸长和相对生长率（RGR），并改善体外（ex vitro）生根能力，显示出作为高效、低成本微繁殖替代方案的潜力，尽管基因型特异性反应（如P. avium在TIB中出现的玻璃化及相关胁迫）提示仍需进一步优化培养条件。
甜樱桃，作为一种广受欢迎的蔷薇科果树，其果实深受消费者喜爱。为了满足市场对高品质樱桃日益增长的需求，果农们不断引进改良品种和先进种植技术。然而，樱桃树的繁殖并非易事，尤其是其基础——砧木的繁殖。传统上，嫁接是繁殖甜樱桃的主要方法，这需要将优良品种（接穗）与强健的砧木相结合。砧木的质量直接影响整棵树的生长势、抗逆性和最终产量。因此，大规模、高效率地生产遗传性状一致且健康的砧木苗木，成为樱桃产业可持续发展的关键一环。
植物组织培养技术，即微繁殖，为这一需求提供了解决方案。它能在无菌条件下，利用一小块植物组织快速克隆出大量遗传一致的植株。长期以来，甜樱桃砧木的微繁殖主要依赖半固体培养基。这种方法虽然可行，但存在明显短板：需要频繁地进行继代培养，耗费大量人工和材料成本，且繁殖速度有时不尽如人意。此外，在培养过程中，植株容易出现一种称为“玻璃化”的生理失调现象，表现为组织透明、含水过多、形态异常，严重影响后续移栽成活率。
那么，有没有一种方法能克服这些缺点，实现更高效、更经济的砧木微繁殖呢？临时浸没生物反应器（Temporary Immersion Bioreactor， TIB）系统进入了研究人员的视野。与将植物组织持续浸泡在液体中或固定在半固体培养基中不同，TIB系统通过定时、短暂地将培养物浸入液体培养基，然后排出，使其暴露在空气中。这种“浸泡-通气”的循环模式，既保证了养分和水分的有效吸收，又提供了充足的氧气，理论上能促进更快生长、积累更多生物量，并改善整体植株质量，同时减少操作时间和单株成本。其中，SETIS?是一种设计紧凑、用户友好的TIB系统。
为了验证TIB系统，特别是SETIS?，在甜樱桃砧木微繁殖中的应用潜力，并系统评估其效果，一个研究团队开展了一项针对性研究。他们的成果发表在《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》期刊上。该研究旨在解决的核心问题是：与传统半固体培养基相比，使用SETIS? TIB系统进行甜樱桃砧木微繁殖，能否在提高繁殖效率（如芽增殖、生长）和改善植株质量（如生根能力、生理状态）方面展现出优势？同时，不同基因型的砧木对这两种培养系统的反应是否存在差异？
为了回答这些问题，研究人员选取了两个重要的甜樱桃砧木基因型：传统的实生砧木野樱桃（Prunus avium，简称Pa）和商业化的矮化砧木Gisela 6（Prunus cerasus与P. canescens的杂交种，简称G6）。研究的主要技术路径包括：首先，建立两种砧木的离体培养体系；然后，将其茎段分别置于半固体培养基和SETIS? TIB系统中进行增殖培养；接着，对培养28天后的芽进行多项指标评估，包括增殖数量、芽长、相对生长率（Relative Growth Rate， RGR）以及体外生根能力；最后，还对再生苗进行了深入的生理生化分析，测定了光合色素（叶绿素a、b和类胡萝卜素）含量、总黄酮、丙二醛（Malondialdehyde， MDA，脂质过氧化产物，反映氧化胁迫程度）和脯氨酸（一种常见的渗透调节物质和胁迫指标）水平，以全面评估不同培养系统下植株的生理状态和可能的胁迫响应。
本研究采用了对比实验设计，核心是比较半固体培养基与SETIS?临时浸没生物反应器（TIB）两种培养系统对甜樱桃砧木微繁殖的影响。关键技术方法包括：1) 离体建立与增殖：从葡萄牙苗圃的母株上采集春季萌发的嫩枝，经过表面消毒后，以茎段为外植体，在添加了细胞分裂素（BA）和赤霉素（GA3）的MS培养基中，于半固体容器或SETIS? TIB（设定为每8小时浸没5分钟）中进行为期28天的增殖培养。2) 生长与生根评估：测量增殖后的芽数、最长芽长度，计算相对生长率（RGR），并对增殖芽进行体外（ex vitro）生根诱导（使用IBA处理），统计生根率、根数和根长。3) 生理生化分析：采集培养后的芽样品，经液氮速冻、冻干后，采用分光光度法测定光合色素、总黄酮、MDA和脯氨酸含量，以评估植株的生理状态和胁迫水平。
研究结果
离体建立
研究成功建立了两种砧木的离体培养体系。在春季相对干燥的条件下采集外植体，有利于降低污染率。野樱桃（Pa）和Gisela 6（G6）的离体建立成功率分别为56%和62%，为后续的增殖实验奠定了基础。
SETIS?中的芽增殖
对比两种培养系统发现，TIB在促进芽伸长方面具有显著优势。对于G6，TIB培养的芽中位长度（2.5 cm）显著高于半固体培养基（2.0 cm）。对于Pa，TIB的芽长（2.1 cm）也显著优于半固体培养基（2.0 cm）。在增殖芽数量上，G6在TIB中显示出更有利的分布，而Pa在两种系统中无显著差异。相对生长率（RGR）指数进一步证实，TIB系统在促进生物量积累和芽增殖方面性能更优。然而，研究也观察到一个重要问题：Pa基因型在TIB中出现了较高程度的玻璃化现象，表现为组织透明、含水过多，这可能影响了其生长表现。而G6在两个系统中表现更为稳定。
TIB在体外生根方面优于半固体培养基
体外生根对于微繁殖苗木的后期移栽至关重要，但也是甜樱桃砧木繁殖中的一个难点。本研究中，从TIB系统获得的增殖芽表现出更强的体外生根能力。G6在TIB中的生根率达到57%，远高于在半固体培养基中的16%；Pa在TIB中的生根率为44%，也显著高于在半固体培养基中的10%。此外，G6从TIB获得的生根苗，其根数和根长也显著优于半固体培养基来源的苗。这表明，尽管TIB中可能伴随玻璃化等问题，但其培养出的芽在生根阶段具有更好的恢复和发育潜力。
繁殖方法对光合色素、次生代谢物和胁迫标志物的影响
生理生化分析揭示了不同培养系统和基因型对植株内部状态的复杂影响：
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光合色素：对于G6，两种培养系统间的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量无显著差异。然而，对于Pa，TIB培养的植株其所有光合色素含量均显著低于半固体培养基。这很可能与Pa在TIB中出现的玻璃化胁迫有关，胁迫干扰了正常的生理代谢过程。
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总黄酮：总黄酮含量在不同培养系统和基因型间均未发现显著差异，表明该次生代谢物水平未受本实验培养条件的影响。
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丙二醛（MDA）：MDA是脂质过氧化的产物，指示氧化胁迫水平。Pa基因型的MDA含量在所有条件下均高于G6，且在TIB中数值更高，这与Pa在TIB中观察到的玻璃化现象相符，表明其经历了更严重的氧化损伤。
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脯氨酸：脯氨酸是一种渗透调节物质，其积累常与胁迫响应相关。Pa的脯氨酸含量高于G6，但同一基因型在不同培养系统间无显著差异。这提示脯氨酸的积累可能更多受基因型本身的调控，而非本实验中的培养系统。
研究结论与意义
本研究首次系统报道了使用SETIS?临时浸没生物反应器（TIB）进行甜樱桃砧木微繁殖。总体而言，研究证实了TIB系统相对于传统半固体培养基的显著优势：它能有效促进甜樱桃砧木芽的伸长和生物量积累（更高的RGR），并大幅改善其后期的体外生根能力，从而为获得更多可移栽的优质苗木提供了更高效的途径。这为樱桃产业大规模、低成本生产砧木提供了有前景的技术替代方案。
然而，研究也揭示了重要的挑战和复杂性。优势并非普遍存在，而是呈现出明显的基因型依赖性。商业砧木Gisela 6在TIB中表现稳健，生长和生根均得到改善，且未出现严重的生理失调。相反，传统砧木野樱桃（P. avium）在TIB中虽然生长和生根也有所改善，但却伴随着较高的玻璃化发生率和相关的生理胁迫迹象，表现为光合色素含量降低和氧化损伤标志物（MDA）水平升高。这一对比强烈提示，在将TIB技术应用于不同甜樱桃砧木乃至其他树种时，“一刀切”的优化方案可能不适用，必须针对特定基因型调整培养参数（如浸没频率、激素配比、通气条件等），以在发挥TIB效率优势的同时，最大限度地控制玻璃化等质量问题。
此外，研究通过系统的生理生化分析，将宏观的生长表现与微观的细胞状态联系起来，为评估和优化微繁殖体系提供了更深入的见解。例如，MDA和脯氨酸的测定有助于量化不同基因型对培养环境胁迫的敏感性和响应方式。
综上所述，这项研究不仅展示了SETIS? TIB系统在甜樱桃砧木微繁殖中的实用潜力，推动了园艺作物生物技术育苗的进步，更重要的是，它强调了在应用先进繁殖技术时考虑基因型特异性的至关重要性。未来的研究应致力于细化TIB操作参数，特别是针对易感玻璃化的基因型，探索如何通过调控培养环境来平衡生长效率与植株质量，最终实现该技术在商业化生产中的稳定、高效应用。
