《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Distinct, Depth-Stratified Communities of Heterotrophic, Mixotrophic, and Parasitic Dinoflagellates and Ciliates in the Subarctic Northeast Pacific Euphotic Zone
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本研究通过对2018年EXPORTS航次样品的18S rRNA高通量测序，揭示了海洋透光带中甲藻与纤毛虫消费者的深度分层群落结构。超过90%的原生生物消费者ASV倾向于出现在表层或混合层以下，其中寄生性甲藻（Syndiniales）占主导（52%），但大部分难以在属水平鉴定，暗示了未知寄生类群在海洋食物网中的潜在重要性。频繁出现的肉食性纤毛虫表明“捕食者-捕食者”捕食，通过重复的营养级转移驱动碳循环。这项研究指出，这些深度分层的原生生物消费者的活动调控着海洋上层的碳流，并可能解释东北太平洋目前未归因的出口生产力损失。
1 引言
异养原生生物在浮游生物群落中显著影响着固定碳在食物网中的转化与运输，并对海洋表层有机物的输出量与时机起着关键作用。其生物地球化学影响受到一系列营养模式的影响，包括严格的异养（即微型浮游动物）、兼养（例如兼具光合与吞噬能力）以及寄生（例如感染并裂解宿主细胞）。由于许多捕食者和寄生虫具有特定的猎物/宿主偏好，它们的群落组成、摄食策略和输出生产力密不可分。
在东北太平洋，甲藻和纤毛虫的摄食活动已知会限制浮游植物的丰度。本研究在2018年NASA EXPORTS现场活动期间，于海洋观测站Papa（OSP）附近采集了样品。OSP是亚北极东北太平洋高硝酸盐、低叶绿素（HNLC）区域中一个研究充分的寡营养生境。研究利用18S rRNA V4区的高通量扩增子测序，分析了甲藻和纤毛虫的摄食模式与深度分布，旨在测试以下两个假设：(1) 在OSP附近相对稳定的晚夏环境中，这些群落的分类组成和ASV丰富度随时间变化较低；(2) 群落组成、ASV丰富度和营养模式表征在分层的透光带中存在显著差异。
2 材料与方法
所有现场样品于2018年8月16日至9月7日期间，在R/V Roger Revelle号上以拉格朗日框架每日采集。样品通过配备传感器的24瓶Niskin采水器，在表层至75米（约1%光合有效辐射，PAR）的多个离散深度采集。每个深度将200微米预过滤的10升海水，使用蠕动泵通过0.2微米孔径的聚醚砜膜过滤收集生物量，并用RNAlater缓冲液保存于-80°C。
测序数据使用DADA2包（版本1.16）进行分析，并使用Phyloseq在R（v3.4.3）中可视化。使用Protist Ribosomal Reference (PR2v4.14.0)数据库，通过朴素贝叶斯分类器算法（最小引导置信度80%）为扩增子序列变体（ASV）分配分类学信息。随后，使用营养模式数据库（TMDv1.1）为分配给甲藻和纤毛虫类群的ASV分配营养模式。该数据库包含500多项关于甲藻和纤毛虫消费者的研究，涵盖摄食行为观察、生物体生理学、叶绿体荧光显微镜检查以及光合作用或消化的分子指标。为确保严谨性，仅保留有经验证据支持营养模式的分类单元。
所有统计分析均使用ASV的有无数据，以避免基因拷贝数偏差。使用Tukey–Kramer检验（样本数n≥ 3）和事后Kruskal-Wallis秩和检验，评估了巡游期间（年日YD 228–250）和水柱（5–75米）中捕食者和寄生生物群落的分类丰富度差异。通过计算每个ASV的出现频率和比值比，确定了其在混合层以上和以下（至75米）出现的可能性。为了检查组成变化并与环境变量关联，对存在-缺失数据应用Hellinger转换后，进行了基于转换的冗余分析（tb-RDA），并使用k-means聚类分析对ASV存在矩阵进行分组。
3 结果
3.1 序列多样性与代表性类群
共分析了54个样品的真核浮游生物群落（>0.2微米），获得了6,723,853条高质量的18S V4 rRNA基因区域reads。去除低reads计数的ASV后，最终数据集包含712个ASV，其中602个属于甲藻门，110个属于纤毛虫门。这些ASV分布在26个不同的目中。
异养和兼养ASV在纤毛虫和甲藻群落中均有鉴定，但两个门类中ASV在不同营养模式和分类水平上的分布存在差异。大多数异养和兼养纤毛虫至少可以鉴定到科水平。而异养和兼养甲藻ASV大多可在属/种水平分类，而几乎所有的寄生性和未分类营养模式的甲藻ASV仅能鉴定到纲水平。约一半（52%，n=370）的甲藻和纤毛虫ASV被归类为寄生性甲藻纲Syndiniales。
在甲藻中，寄生群落的ASV丰富度显著高于异养或兼养群落。寄生类群Dino-Group (DG) II在数据集中具有最高的ASV丰富度，几乎是第二大贡献者——可能包含任何营养模式（包括专性自养生物）的甲藻目Dinophyceae_X的四倍。
3.2 群落结构和ASV出现的时间与垂直模式
除了某一天（YD 236）的兼养丰富度显著较低外，ASV丰富度随时间没有显著变化。在整个巡游期间，透光带内每日ASV丰富度范围为：异养者25-40个ASV，兼养者50-80个ASV，寄生者67-168个ASV。
表层混合层（5米至混合层深度MLD，平均30.4米）群落的ASV丰富度显著低于MLD至75米之间出现的群落。尽管存在深度上的丰富度差异，超过一半的ASV在两个深度层中都存在。兼养ASV丰富度的垂直结构最不明显，69%的ASV在表层混合层和下方均有发现。对于所有营养模式，混合层以下群落的独有ASV数量是表层混合层的1.5到7倍。超过三分之一的异养和寄生ASV仅出现在混合层以下。
尽管大部分ASV在两个深度层都存在，但单个ASV表现出不同的出现频率模式。例如，甲藻Gyrodinium helveticum（2个ASV）在两个深度层95%-100%的样品中出现；而甲藻Islandinium tricingulatum（1个ASV）几乎只出现在表层混合层（75%的样品）；纤毛虫Leegaardiellasp.（3个ASV）则在至少75%的混合层以下样品中出现，在表层混合层样品中出现率低于10%。总体而言，异养、兼养和寄生ASV的出现频率在表层混合层和混合层以下之间存在显著差异。
通过计算每个ASV出现的概率，发现超过90%的原生生物消费者ASV更可能出现在表层水域或混合层以下，而不是整个水柱中。
3.3 捕食者与寄生生物群落的环境相关性
线性回归分析表明，异养、兼养和寄生ASV丰富度值与深度高度相关。异养和寄生ASV丰富度与深度呈正相关，而兼养ASV丰富度与深度呈负相关。ASV丰富度与总叶绿素-a或摄食率之间没有显著关系。
基于存在-缺失数据的群落组成与每个摄食模式的深度和采样日期均显著相关。对于每个营养模式，ASV出现的大部分变异性（77%–78%）由第一轴解释，该轴也与深度显著相关。第二轴解释了数据集中剩余的变异，并且与采样日期显著相关。与摄食率和叶绿素-a浓度没有显著关联。对ASV出现情况的k-means聚类分析将现场样品分为两个聚类（k=2）：表层混合层和混合层以下，它们在排序空间中沿深度向量分离。
3.4 与深度分层群落相关的频繁出现ASV
通过分析ASV的出现频率以及与tb-RDA中k-means聚类相关的排名前30的ASV，确定了在MLD以上、以下以及在整个透光带普遍存在的类群。
在异养捕食者中，来自多样化的Gyrodinium属的无甲板甲藻在整个透光带最为普遍。表层异养群落的特征是高频率出现（出现于>50%的样品中）选择性植食者G. dominans、Protoperidinium pellucidum和I. tricingulatum，以及肉食性Askenasiasp.。表层组合还与这些高频率出现的类群以及其他选择性植食者（如Leegaardiellasp.、Pelagostrombidiumsp.和铃壳虫）强相关。一些相同的异养属但不同的ASV也与混合层以下组合相关，包括Leegaardiella、Pelagostrombidium和多个已鉴定的Gyrodinium物种ASV。此外，混合层以下组合还与来自纲Nassophorea(NASSO) 和Oligotrichea(OLIGO5) 的广谱植食性纤毛虫、高频率出现的肉食性Askenasiasp.以及来自纲Phyllopharyngea (PHYLL) 的ASV相关。
兼养群落由构成性兼养甲藻（具有自身光合系统）和非构成性兼养纤毛虫（通过摄取自养猎物或窃取质体获得光合能力）构成。表层兼养群落以高频率出现的构成性兼养甲藻（如Karenia brevis、Gymnodinium dorsalisulcum和Pentapharsodiniumsp.等）以及非构成性兼养纤毛虫Varistrombidium kielum为特征。该组合还与构成性兼养甲藻Tripos fusus、Biecheleriasp.、Gonyaulaxsp.和Amphidoma languida的出现强相关。在混合层以下，构成性兼养甲藻如Karlodinium veneficum、K. bicuneiformis和Scrippsiella acuminata在群落中频繁出现。来自相同分类群的独特兼养ASV在每个深度组合中频繁出现并强相关，例如来自Gymnodinium、Heterocapsa和Prorocentrum属的ASV。
寄生组合与深度强相关。来自甲藻类群I-III的ASV构成了各深度层中前130个最频繁出现的ASV（出现于>50%的样品）。甲藻类群IV（1个ASV）由数据集中唯一鉴定到属的Syndiniumsp.代表，并且仅在9%的表层混合层样品中出现。与异养和兼养者相比，寄生谱系较差的分类学分辨率限制了对与表层和混合层以下组合相关的显著ASV向量的分类学解释。
4 讨论
4.1 异养捕食者中多样的摄食策略
异养捕食者根据其摄食策略和猎物偏好占据不同的生态位。它们占据了数据集中所有已鉴定目的50%，突出了该营养模式下生物的分类多样性。先前的研究已确定Gyrodiniumspp.和无壳纤毛虫是OSP异养群落的重要成员。这些生物在我们的数据集中也存在，并且都包含许多频繁出现的ASV。异养捕食者ASV还包含了深度分层的群落，其中既有广谱性植食者，也有选择性植食者和肉食者。肉食性捕食者的存在，如纤毛虫Askenasia，其能够消耗包括其他纤毛虫在内的广泛尺寸范围的猎物，引入了种间捕食的可能性，可能通过“捕食者-捕食者”捕食调节微浮游动物生物量，并将碳重新包装到下沉颗粒中，从而影响碳流。
4.2 普遍存在的兼养者及其灵活的营养角色
与捕食者类似，兼养者在分类学和摄食生态学上都具有多样性。兼养群落由构成性和非构成性兼养者混合组成。假定的构成性兼养甲藻（如Karlodinium、Karenia、Gymnodinium和Heterocapsa）在整个群落中最为普遍，而纤毛虫ASV则主要来自Strombidiida目的非构成性兼养者。光照强度可以驱动兼养者的生长和摄食率，并有助于确定它们在水柱中的物理位置。在我们的研究中，光是几个与兼养群落组成相关的环境变量之一。除了光照，食物供应似乎也能调节光合与吞噬作用的平衡。在OSP，非构成性兼养纤毛虫群落在混合层以下频繁出现，表明存在适应弱光条件和/或更依赖吞噬作用获取能量的兼养者。
4.3 寄生虫：普遍、多样且具有改变海洋食物网碳流的潜力
寄生生物的分类学身份和活动在很大程度上仍是一个黑箱，限制了我们对其在浮游生物食物网中作用的理解。寄生性甲藻纲Syndiniales构成了我们数据集中超过一半的ASV，但没有一个被鉴定到种水平，只有一个鉴定到属水平。这种分类学局限性凸显了人们对这些生物知之甚少。我们在数据集中鉴定到的唯一属水平ASV——Syndinium，是一个已知能感染并杀死桡足类和放射虫等多种生物的广布属。Syndiniales既包含专门感染特定宿主物种的类群，也包含感染更广泛物种的类群，这表明OSP水体中存在的Syndiniales类型可能影响群落组成和有机物循环。我们观察到的Syndiniales在透光带内的垂直分层可能由宿主偏好和生命周期进程驱动。值得注意的是，游离的dinospores可以在宿主外存活数天，并可以作为微浮游动物捕食者（如纤毛虫）的营养，将有机碳保留在透光带微生物食物网内。
4.4 消费者原生生物平衡输出收益与损失
对微型浮游动物生物量（及其摄食影响）的控制是调节碳通过浮游生物食物网通量的关键，但很大程度上未知。我们的工作为巡游期间可能控制微型浮游动物摄食的因素提供了一些见解。巡游期间基于钍-234测量的碳通量推断，大部分净群落生产力转化为下沉的颗粒有机碳（POC）。然而，巡游期间对中型浮游动物摄食的估计不足以控制OSP晚夏时期微型浮游动物的种群丰度和摄食影响，表明存在其他调控机制。同样，摄食率与异养群落指标（即ASV丰富度和组成）之间的相关性较差，可能是由于物种间摄食行为的差异，或者是捕食者组成的生物量变化所致，而这未被我们的宏条形码分析捕获。我们在整个透光带鉴定出了一个多样化的肉食性群落，为种间捕食（肉食性）作为控制微型浮游动物生物量的一种机制提供了可能性。除了肉食性，寄生也可能控制微型浮游动物种群的规模。肉食性及其相关呼吸作用的累积影响，加上感染捕食者并将颗粒碳转移至溶解相的寄生作用，可能解释了OSP系统（尤其是在2018年EXPORTS巡航期间）目前未归因的出口生产力损失，指出了这些调控海洋上层碳流的微生物的潜在重要性。
