《Journal of Extracellular Biology》：Molecular Characterization of Extracellular Vesicles From Human B Cell Lymphomas: Methodological Comparison to Vesicles From Patient Serum
引言：细胞外囊泡作为淋巴瘤液体活检的新兴工具
细胞外囊泡（EVs）是由几乎所有细胞分泌的膜包被纳米结构，携带蛋白质、脂质、核酸等活性分子，在细胞间通信中扮演关键角色。其内容物反映亲本细胞的生理或病理状态，因此在诊断、预后及治疗应用中展现出巨大潜力。EVs主要包括外泌体与微泡等亚型，它们在尺寸、生物发生及分子组成上有所不同。在血液等生物体液中浓度很高，且水平随疾病状态波动。
在血液恶性肿瘤中，B细胞淋巴瘤是一类异质性疾病，其中弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是最常见的亚型，约占新诊断非霍奇金淋巴瘤的40%。DLBCL具有显著的异质性，基于基因表达谱可分为生发中心B细胞样（GCB）和活化B细胞样（ABC）两大分子亚型。目前的基因分型方法（如基因表达谱分析）存在组织样本获取不便、RNA降解等局限。液体活检作为一种微创技术，利用循环生物标志物（包括细胞游离DNA、循环肿瘤细胞和EVs）进行分子分析，正成为克服这些局限的新途径。其中，EVs因其在循环中持续存在且能反映肿瘤特异性分子特征而备受关注。然而，对淋巴瘤EVs及其在患者样本混合EVs中检测B细胞特异性标志物的研究仍不足，了解其在识别B细胞特异性EV特征方面的潜力至关重要。
EVs的分离与分析因其纳米级尺寸及血浆或血清等生物基质的复杂性而面临挑战。这些挑战在DLBCL研究中尤为突出，血清与细胞培养来源EVs的表征技术直接比较有限，分离方案和分析目标的不一致进一步阻碍了可重复性和标准化工作流程的建立。研究血液来源的EVs对于获得临床可转化的发现至关重要，而细胞系来源的EVs对于机制研究和生物标志物发现仍然不可或缺。当前EV研究在表征技术（如纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）、质谱（MS）、蛋白质印迹（WB）和酶联免疫吸附测定（ELISA）等免疫分析）的使用上差异显著，导致数据不一致，使跨研究比较复杂化。四跨膜蛋白（如CD9、CD63和CD81）的表达谱被用来评估不同样本类型中EV的富集度、纯度和异质性，并有助于对EV群体进行分类。
本研究聚焦于DLBCL及其两个主要亚型的EV特征，以及淋巴瘤患者血清EVs。通过评估关键参数，如EV蛋白质组、四跨膜蛋白的特异性表达以及淋巴瘤特异性标志物（CD19和CD20），比较了不同分析技术的相对性能和局限性。尽管样本量有限，这项方法学研究为开发用于淋巴瘤分析和未来潜在患者分层的非侵入性方法提供了见解。
材料与方法
细胞培养与EV收集
研究使用了四种DLBCL细胞系：U-2932（U-2）和Riva（Ri）属于ABC亚型；SUDHL-4（S-4）和OCI-LY7（O-7）属于GCB亚型。细胞在添加10%胎牛血清（实验前使用无外泌体血清）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养。收集条件培养基，通过离心去除细胞碎片，并使用10 kDa截留分子量的离心过滤器浓缩，然后进行高速离心去除残余碎片。EV富集的上清液立即进行基于尺寸排阻色谱（SEC）的EV分离或储存于-80°C备用。
血清样本收集
在获得伦理批准（编号72/1801/2018）后，收集了四名B细胞淋巴瘤患者（包括DLBCL、霍奇金淋巴瘤和小淋巴细胞淋巴瘤）的血清样本。静脉血采集至EDTA管中，分离血清并储存于-80°C。
尺寸排阻色谱法：从细胞培养物和血清样本中分离EVs
使用qEV single Gen2 70 nm SEC柱从浓缩的细胞培养上清液和血清样本中分离EVs。上样150 μL样本，收集馏分1-8，并将每两个连续馏分合并为最终的四个样品F1-F4。为下游分析，将合并的馏分F1-F3（来自SEC的馏分1-6）合并为一个管，馏分F4不包含在下游分析中。收集的EV馏分使用Amicon蛋白浓缩器（10 kDa MWCO）进行浓缩，通过NanoDrop分光光度计测量蛋白质浓度，样品储存于-80°C。
透射电子显微镜
采用标准化负染方案进行TEM观察EVs。优化后的方案使用1%乙酸双氧铀染色1分钟，以获取更佳图像对比度。将固定后的EV样品置于碳涂层铜网上，染色后空气干燥，使用JEM-1400透射电镜在80 kV下成像。
EVs的免疫染色
为了检测EV表面标志物，对细胞培养和患者血清来源的EVs进行了免疫金标记。碳涂层铜网经等离子体处理以增强亲水性。固定的EV样品置于封闭液中孵育，然后与小鼠抗人CD9或CD81一抗孵育，接着与10 nm金标记的驴抗小鼠二抗孵育。最后用1%戊二醛固定，乙酸双氧铀染色并干燥后通过TEM成像。
免疫分析
采用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）定量DLBCL细胞系和血清EVs中四跨膜蛋白CD63和CD81的表达。链霉亲和素包被的96孔板用生物素化一抗包被，加入EV样品孵育，然后加入铕标记的纳米颗粒偶联抗体，用板式读数器测量荧光信号。同时，采用生物素-链霉亲和素荧光免疫分析（BSFIA）检测EVs中的CD9。为提高血清来源EVs的检测灵敏度，样品先用0.1% Triton X-100透化处理。
蛋白质印迹
通过WB分析细胞系和患者血清来源EVs中表面和腔内EV相关蛋白的存在。EV样品在4%–20%预制聚丙烯酰胺凝胶上进行非还原条件电泳，并转印至硝酸纤维素膜。使用针对CD9、CD81、CD44、HSP70、CD19、CD20和ApoA1的一抗进行孵育，然后与荧光标记的二抗孵育，使用Odyssey CLx成像系统检测信号。
纳米颗粒跟踪分析
使用ZetaView PMX-120、NanoSight Pro和NS300系统测量DLBCL细胞系和患者血清来源EVs的尺寸分布和浓度。EV样品用过滤PBS稀释至最佳颗粒浓度，仪器使用聚苯乙烯微珠校准，测量在受控温度下进行，记录视频并使用专用软件分析颗粒尺寸和浓度。
质谱分析
在Turku蛋白质组学设施进行MS分析，以表征SEC纯化的细胞培养和患者血清来源EVs的蛋白质含量。采用数据非依赖性采集（DIA）LC-MS/MS方法进行定量蛋白质组学。EV样品裂解后，蛋白质经还原、烷基化，并用胰蛋白酶消化。肽段通过Evosep One LC系统分离，并在timsTOF fleX MALDI-2质谱仪上使用dia-PASEF模式进行分析。原始数据使用Spectronaut软件处理，使用人类UniProt数据库进行蛋白质鉴定，并使用MaxLFQ进行无标记定量。
统计与图像分析
使用配对t检验、单因素方差分析和双因素方差分析进行统计学评估。对于MS数据，进行单因素方差分析和数据归一化。数据归一化通过将最低强度值设为0，最高值设为100来实现。使用GraphPad Prism、Microsoft Excel和OriginLab进行统计计算和图表生成。
结果
EV表征
TEM评估显示，细胞培养来源的EVs呈典型的杯状形态，而血清来源的EVs主要呈圆形且边界更均匀。值得注意的是，DLBCL亚型间EV形态和丰度存在差异：ABC亚型（U-2， Ri）产生更小、更丰富的EVs，而GCB亚型（S-4， O-7）产生更大但数量较少的囊泡。血清来源的EVs在患者样本间存在较大变异性。
ABC来源的EVs更小，U-2 EVs范围为30–170 nm，Ri EVs为40–80 nm。GCB来源的EVs尺寸分布更大：S-4 EVs范围为100–250 nm，显著大于U-2、Ri和O-7的EVs。血清来源的EVs也表现出显著的个体间异质性，尺寸分布各异。
NTA分析（ZetaView PMX-120）显示，细胞系EVs的中位直径分别为：U-2（128.5 nm）、Ri（106.5 nm）、S-4（143.9 nm）、O-7（125.6 nm）。颗粒主要范围在≈70–340 nm之间，GCB来源的EVs显示出更宽和更高的尺寸分布。在浓度方面，ABC细胞系Ri和U-2的平均颗粒计数分别为8.7 × 1010和7.1 × 1010颗粒/ml，高于GCB细胞系S-4（2.8 × 1010颗粒/ml）和O-7（2.0 × 1010颗粒/ml）。血清EVs明显更小，中位直径在97.1至107.3 nm之间，颗粒浓度在3.6 × 1010至8.3 × 1011颗粒/ml之间。NTA分析与基于TEM图像的手动测量在总体EV尺寸趋势上一致，尽管不同技术间的平均尺寸差异很大，这凸显了评估EV制备物尺寸的复杂性。
通过免疫金TEM检测EV表面标志物
免疫金TEM（iEM）用于定位DLBCL细胞系和患者血清来源囊泡上的关键EV表面标志物（CD9和CD81）。ABC亚型细胞系（U-2和Ri）的EVs对CD9和CD81均显示出清晰的金颗粒标记。在GCB亚型中，S-4 EVs可见但标记强度较低，而O-7 EVs显示最弱的染色，表明表面标志物表达较低。相比之下，血清来源的EVs使用与细胞系EVs相同的染色方案未能实现功能性标记。尝试用0.1% Triton X-100透化患者来源的EVs，但此过程导致囊泡从电镜载网上脱落，阻碍了成功成像。这些发现凸显了对血清来源EVs使用与细胞系来源囊泡相同的iEM实验方案的技术限制。
DLBCL亚型中的四跨膜蛋白表达：基于免疫分析的分析
使用TRFIA和BSFIA对CD9、CD81和CD63进行EV标志物的定量分析。所有测量均在来自U-2、Ri、S-4和O-7细胞系以及血清来源EVs（用于CD9）的EVs上进行，并归一化至蛋白质浓度。
在BSFIA分析中，在所有DLBCL来源的EVs中均检测到CD9，但表达水平不同。CD81水平在所有样本中均显著高于CD63，ABC型EVs（尤其是Ri）显示出最强的表达。在GCB来源的EVs中，S-4 EVs的CD81表达水平高于O-7 EVs。与CD9和CD81相比，所有样本中的CD63水平持续较低。综合来看，免疫分析数据突显了ABC亚型EVs中CD81和CD9表达升高的模式。这些发现通过外包的Leprechaun分析（Unchained Labs）得到加强，该分析采用直接芯片结合抗体捕获CD81、CD63和CD9阳性EVs。根据该分析，所有三种四跨膜蛋白在ABC细胞EVs（Ri和U-2）中的表达量至少是GCB细胞EVs（S-4或O-7）的10倍。在血清来源的EVs中，使用相同技术分析，所有三种四跨膜蛋白在所有4个样本中均有适度但可变的表达。相比之下，通过免疫荧光染色观察，四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81在所有细胞系中均等表达，ABC和GCB细胞系间的标志物表达没有明显差异。使用BSFIA也测量了血清来源EVs（0.1% Triton-X 100透化）中的CD9表达；在所有四个样本中均发现CD9存在，但表达存在差异且适度。这些结果与iEM发现一起表明，免疫分析在检测临床血清来源EVs中的表面标志物方面可能比显微镜技术更敏感。
免疫金电镜揭示小型和大型DLBCL EVs上尺寸依赖性标志物表达
为了进一步表征细胞系来源的EVs，进行了免疫金电镜以可视化和量化CD9和CD81的表面表达。定量分析显示，CD9阳性EVs的总体比例在不同细胞系间存在差异，在Ri EVs中观察到最高表达（21.0%），其次是U-2和S-4（均为15.0%），O-7最低（9.6%）。当按EV尺寸分层时，CD9在较大EVs（>100 nm）上比在较小EVs（<100 nm）上更频繁地被检测到。例如，在U-2来源的EVs中，CD9存在于58.0%的大型EVs中，而仅存在于5.0%的小型EVs中。这一趋势在所有细胞系中保持一致，表明CD9在DLBCL中富集到较大EVs中存在尺寸依赖性。同样，CD81表达在ABC亚型EVs中最高，U-2 EVs显示61.5%的阳性，其次是Ri（40.7%）。GCB来源的EVs显示出较低的CD81阳性率，S-4为18.3%，O-7为16.0%。与CD9类似，CD81主要富集在较大的EV群体（>100 nm）中。有趣的是，ABC亚型来源的EVs总体上表现出相对较高的CD9和CD81表达。然而，这些标志物的分布在他们之间略有不同。例如，S-4 EVs显示出较高的CD63（基于先前结果）和CD9水平，但CD81表达相对较低。这表明囊泡标志物组成可能存在亚型特异性异质性。所有细胞系中，小型EVs（<100 nm）的数量均多于大型EVs（>100 nm），但较大的EVs持续携带更高比例的可检测标志物。
这些数据展示了DLBCL来源EVs中四跨膜蛋白表达的细胞亚型（或来源）依赖性和尺寸依赖性模式。CD81和CD9在ABC细胞来源的大型EVs中的强烈富集表明，囊泡表面组成可能反映了DLBCL亚型间潜在的分子差异。
DLBCL细胞系和血清来源EVs的蛋白质组学分析
进行了基于MS的蛋白质组学表征，分析了以下样品：（1）SEC分离的BCL EVs，（2）SEC分离的血清EVs，（3）MagNet富集的血清EVs，（4）普通血清。在所有样品类型中，共鉴定到5269种蛋白质。MS证实了细胞系和血清EVs中均存在大量先前报道的EV相关蛋白质（例如，CD9、Alix、Hsps），其中细胞系EVs显示出比血清来源EVs更多的蛋白质鉴定结果。SEC分离的BCL EVs产生的数量最高（3113），其次是血清富集的EVs（1563），SEC分离的血清EVs（938）和普通血清（562）。这凸显了不同样品基质间的效率差异，以及SEC所实现的优越富集和蛋白质组覆盖深度。
维恩图比较揭示了各组间蛋白质重叠和独特性的程度。共有293种蛋白质是SEC分离的BCL EVs、SEC分离的血清EVs和MagNet富集的血清EVs所共有的。与普通血清相比，有178种蛋白质在所有含EV的馏分中一致检测到，这表明存在一个核心的EV蛋白质组，与样品来源无关。
为了评估EV特异性，将数据集与从Vesiclepedia和ExoCarta整理的前100个EV相关蛋白质进行了比较。这两个数据库中74种规范的EV蛋白质是共同的。与这74种EV蛋白质相比，在SEC分离的BCL EVs中检测到的数量最多（73），其次是血清富集的EVs（59）、SEC分离的血清EVs（52）和普通血清（15）。这证实了EV标志物富集在来自细胞培养上清液的SEC分离囊泡中最为有效。规范的EV标志物，包括CD9、CD81、HSP70、HSP90B1、Alix和Ezrin，在EV丰富的样品中容易检测到，但在普通血清中基本不存在，这证实了有效的EV富集和标志物特异性。
进一步分析这74种EV标志物显示，在四个样品组中存在不同且重叠的表达谱。虽然15种EV标志物在所有制备物中共有，但44种在血清富集的EVs、SEC分离的血清EVs和SEC分离的BCL EVs中常见。仅有6种标志物在BCL EVs中被独特鉴定，这表明EV蛋白质含量存在方法特异性和来源特异性差异。
热图分析说明了关键EV相关蛋白质在血清和细胞系样品间的相对丰度差异。诸如HSP90亚型、膜联蛋白和syntenin-1等蛋白质在细胞系来源的EVs中显示出高表达，而血清EVs表现出更多的变异性和较低的强度，这可能反映了生物学异质性和从血清中获得的EV产量降低。有趣的是，与B细胞淋巴瘤或恶性进展相关并在血清中发现的CD44和Gal3BP（半乳糖凝集素-3结合蛋白）的表达，在所有研究的淋巴瘤细胞系和淋巴瘤患者来源的EVs中都非常丰富。另一方面，四跨膜蛋白和热休克蛋白的定量分析显示，CD9在血清富集的EVs中表达更高，而CD81和HSP90B1在血清和细胞来源的EVs中均被一致检测到。这些结果表明，常见EV标志物的表达或可及性存在差异，取决于样品来源和富集方法。
总而言之，数据表明DIA-MS能够实现稳健的EV蛋白质组学分析，并且SEC提供了有效的EV富集，特别是来自培养的淋巴瘤细胞。比较分析揭示了患者和细胞系来源样品中存在不同的EV蛋白质组特征，为淋巴瘤EV研究中的生物标志物发现和机制研究提供了宝贵的见解。
BCL细胞系和患者血清样品中必需标志物的分析
通过WB分析了SEC分离的ABC型（U-2， Ri）和GCB型（S-4， O-7）细胞系EVs以及四名淋巴瘤患者（Pt#01-Pt#04）血清EVs中膜结合和内部EV标志物的表达。细胞系来源的EVs通常不需要透化来提高规范标志物的表达，并且四跨膜蛋白CD9和CD81在非透化和Triton-X-100透化的样品中均能被同等检测到。有趣的是，正如免疫分析和iEM所示，ABC型U-2和Ri EVs显示出比GCB型S-4和O-7相对更高的四跨膜蛋白表达。另一方面，在血清来源的EVs中，不进行透化则无法检测到四跨膜蛋白，透化处理将CD9信号强度提高到可检测水平：即使经过透化步骤，CD81信号在血清EV样品中也几乎检测不到。类似地，Hsp70和CD44信号在没有样品透化步骤的印迹中几乎检测不到。
重要的是，B细胞特异性标志物CD19和CD20在细胞系EVs中清晰可见，并且透化后CD19表达在血清来源的EVs中也变得更加显著。此外，在细胞系EVs中，在报道的约95 kDa大小处检测到显著的CD19表达。有趣的是，患者血清EVs主要表达一个显著的约200 kDa大小的CD19，反映了血清来源EVs中可能存在的二聚体形成。这一假设通过蛋白质印迹实验得到加强，其中血清来源的样品用或不用还原剂β-巯基乙醇处理以断裂蛋白质间的硫桥：这种处理将CD19信号改变为报道的约95 kDa大小。这引出了一个有趣的问题：与细胞系来源的EVs相比，CD19在血清EVs中分泌或表达的形式。CD20在DLBCL细胞EVs中的表达先前已被证实，并且发现它在U-2和S-4细胞系EVs中表达更显著。然而，在患者血清EVs中，无论使用何种透化步骤，在所评估的四名患者样本中均未检测到CD20的表达。
另一个有趣的标志物，也与BCL发病机制相关的跨膜受体CD44，在此进行了检查。注意到细胞系和血清EVs在没有透化的情况下均显示出微弱或无法检测到的信号，表明其丰度低或表位被屏蔽。有趣的是，腔内标志物HSP70在非透化条件下在细胞系EVs和血清EVs中几乎检测不到，而透化步骤使得在血清EVs中能够强检测。
WB结果验证了细胞系和患者来源样品中表面和腔内EV标志物的存在。透化前后标志物检测的差异性强调了这一步骤的重要性，特别是在研究临床样本时，更复杂的EV表面可能会掩盖抗原表位。
讨论
EVs正在成为血液恶性肿瘤中有前景的生物标志物，然而它们在淋巴瘤中的临床应用仍然受到亚型特异性表征以及在血清等复杂体液中检测挑战的限制。在本研究中，应用了一个多模式的EV表征流程，结合SEC分离、TEM + iEM、免疫分析、WB和MS，平行研究了两种主要DLBCL亚型ABC和GCB以及一个有限的、概念验证队列的淋巴瘤患者来源EVs的特征。研究结果表明，来自DLBCL细胞系的EVs表现出独特的形态学和分子特征。值得注意的是，观察到ABC型细胞释放更小的EVs，其CD81和CD9的富集度显著高于GCB型，后者显示出相对较大的EVs和较低的四跨膜蛋白标志物表达。这些差异与MS、TRFIA和BSFIA免疫分析、WB和iEM分析结果一致。
有趣的是，CD81和CD9都优先富集在较大的EVs（>100 nm）中，这表明标志物分布不仅可能与细胞起源有关，还与EV亚群有关。这些发现扩展了先前关于癌症来源EVs中四跨膜蛋白异质性的报道，并表明四跨膜蛋白，特别是CD81，可能作为未来液体活检应用中DLBCL亚型分层的一个潜在生物标志物。然而，本研究未在此研究患者来源材料中的表达，关于四跨膜蛋白在ABC亚型中富集表达的发现需要在由ABC、GCB和健康供体血清或血浆样本组成的队列中进行扩展和确认。
除了细胞系来源的EVs，还研究了从淋巴瘤患者血清中分离的EVs，以探究在复杂的生物体液中检测B细胞起源标志物的可能性，并比较不同样品类型间的方法学特征。与细胞系样品相比，来自四种不同类型淋巴瘤诊断的血清EVs在尺寸和形态外观上如预期般显示出异质性。应用了相同的实验方案评估样品，MS分析显示几种标志物在细胞系和血清EVs中均被鉴定。然而，验证实验（如ELISA和WB）不能直接应用于血清EVs，而需要样品透化等进一步优化。通过透化步骤，在MS中检测到的分子（以及一些未检测到的）可以在免疫分析和WB分析中成功检测。然而，这种优化并未促进iEM中的标志物检测。尝试透化EVs以暴露内部表位损害了EVs在载网上的结合，进一步凸显了生物流体中EV成像的技术挑战以及进一步优化EM辅助标志物检测的必要性。尽管如此，MS和WB分析均证实了患者来源样品中存在关键的EV标志物，包括CD9、CD81和HSP70，强调了结合正交技术进行全面EV表征的实用性。
除了诊断潜力外，观察到的EV形态和标志物组成的差异也可能反映了DLBCL亚型间EV释放途径的潜在生物学差异。ABC型DLBCL与更具侵袭性的临床病程和增加的代谢活性相关，这可能有助于在这些细胞系中观察到的总EV释放增加。此外，ABC细胞EVs中较高的四跨膜蛋白表达以及CD81和CD9在较大EVs中基于尺寸的富集，提示了亚细胞起源或释放到EVs中的可能差异；然而，这方面未在本项目中进行研究。有趣的是，即使EVs中的相对四跨膜蛋白表达存在显著差异，当通过免疫荧光染色观察时，所有DLBCL细胞系在细胞群体内均表达了相当的CD81、CD9和CD63。通过非侵入性EV表征区分DLBCL亚型的能力为疾病监测开辟了潜在途径，特别是在组织活检难以获取或高风险的情况下。
研究结果也为血液恶性肿瘤EV研究的方法学考量提供了宝贵见解。基于SEC的分离为下游分析提供了足够的EV纯度和产量，这反映在通过DIA-MS鉴定出的高数量EV相关蛋白质以及各分析中一致的四跨膜蛋白检测上。每种表征方法都表现出不同的优势和局限性。值得注意的是，根据Wu等人的方案，从血清中自动磁富集脂质颗粒是有效的，可以作为EV蛋白质组分析的一种更省力的方法。对于特定标志物的靶向验证，注意到即使MS未检测到某些标志物（例如B细胞标志物CD19），当通过WB分析时，该蛋白质存在于所有EVs中。这对于某些表面锚定标志物尤其常见。免疫金TEM成功区分了细胞系EVs中的标志物表达，但在血清来源EVs中受阻，可能是由于蛋白质冠，这是生物流体来源EV分析中反复出现的障碍。这些技术发现支持了最近关于方法标准化和使用互补方法验证EV内容和来源的呼吁。
与DLBCL亚型特异性相关的有趣发现出现在细胞系EVs的MS分析中：其中之一是抗凋亡调节因子BCL-2，据报道与不良预后相关，并在DLBCL的ABC亚型中高表达。BCL-2仅在本数据集的ABC EVs中检测到。另一个有趣的蛋白质命
