单细胞分析揭示FAM117A：连接巨噬细胞-上皮细胞相互作用与肺腺癌进展的关键调控因子

《Experimental Hematology & Oncology》：Single-cell profiling reveals FAM117A as a key regulator linking macrophage–epithelial crosstalk with the progression of lung adenocarcinoma

本文通过单细胞测序技术，系统描绘了肺腺癌肿瘤微环境中的细胞交互网络，揭示了一个由SPP1+巨噬细胞与基底上皮细胞构成的促癌通讯模块（CIM）。研究进一步鉴定出细胞周期调控因子FAM117A是该网络的枢纽抑制因子，其通过与DYRK1A相互作用调控G1/S期转换。FAM117A在肺腺癌组织中表达下调，其缺失增强了巨噬细胞-上皮细胞的正反馈回路，促进肿瘤增殖。研究为靶向巨噬细胞-肿瘤交互与细胞周期调控的联合疗法提供了理论依据。

　　

引言

肺腺癌（LUAD）是最常见的肺癌亚型，是全球癌症相关死亡的主要原因之一。尽管在分子靶向治疗和免疫治疗方面取得了进展，但晚期肺腺癌患者的预后仍然不佳，这在很大程度上归因于深刻的肿瘤异质性和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。肿瘤微环境是一个动态的复杂生态系统，由恶性上皮细胞、浸润性免疫细胞、成纤维细胞等组成，其成分通过可溶性因子、配体-受体信号传导等方式相互沟通，影响肿瘤行为。其中，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）扮演着关键角色，越来越多的证据表明巨噬细胞的极化、空间定位与肺腺癌的侵袭性密切相关。

与此同时，细胞周期的肿瘤内源性调控因子决定了恶性行为和治疗敏感性。其中，序列相似性117家族成员A（FAM117A）最近被报道为G₁/S转换的新型调节因子。FAM117A通过与双重特异性激酶DYRK1A相互作用来维持细胞周期停滞和基因组稳定性。因此，本研究旨在通过结合单细胞转录组学和功能实验，描绘巨噬细胞（Mps）与上皮肿瘤细胞在肺腺癌进展过程中的相互作用，并阐明FAM117A在该调控网络中的机制作用，从而为开发靶向巨噬细胞调控与精准细胞周期治疗的联合策略提供依据。

方法

本研究收集了来自中国人民解放军总医院第一医学中心胸外科接受手术治疗的肺腺癌患者组织样本。同时整合了单细胞RNA测序数据集GSE131907、GSE189357以及内部队列的数据，构建了涵盖正常组织、原位腺癌（AIS）、微浸润腺癌（MIA）和浸润性腺癌（IAC）共28个样本的单细胞图谱。样本使用蛋白酶混合物消化后制备单细胞悬液，遵循Chromium单细胞3‘试剂盒标准协议进行建库和测序。数据处理使用Cell Ranger和Seurat R包，进行降维、聚类和细胞类型注释。细胞通讯分析使用CellChat和NicheNet进行。为了评估临床相关性，基于单细胞数据提取特征基因集，利用基因集变异分析（GSVA）在TCGA肺腺癌数据集中进行富集和生存分析。此外，构建了一个由SPP1⁺巨噬细胞、基底细胞及其相互作用基因组成的细胞通讯模块（CIM）基因集，并通过LASSO Cox回归模型筛选出与预后最相关的13个基因，建立CIM评分系统。实验验证方面，采用多重免疫组化（mIHC）、免疫印迹（Western Blot）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）、免疫共沉淀（Co-IP）和质谱分析等技术检测蛋白表达、相互作用及信号通路。此外，通过体内异种移植瘤模型评估FAM117A敲低对肿瘤生长的影响。

结果

1. 肺腺癌生态系统的单细胞图谱

通过整合公共和内部单细胞数据，共分析了152,686个高质量细胞，并鉴定出12个主要细胞类型，包括T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞、巨噬细胞（Mps）、肥大细胞、中性粒细胞、树突状细胞（DC）、浆细胞样树突状细胞（pDC）、上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞。分析揭示了不同肺腺癌进展阶段（N、AIS、MIA、IAC）中细胞组成的动态变化。

2. 肺腺癌中的巨噬细胞亚群及其免疫活性

巨噬细胞被进一步细分为不同亚群：MARCO⁺Mps、FABP4⁺Mps、SPP1⁺Mps、APOE⁺Mps、S100A8⁺单核细胞、CD1C⁺DC和CLEC9A⁺DC。其中，SPP1⁺Mps的比例随着肺腺癌从非浸润性到浸润性阶段的进展而逐渐增加，预示着其在肺腺癌发展中可能扮演关键角色。基因集变异分析和生存分析显示，SPP1⁺Mps富集与肺腺癌患者的不良预后显著相关。

伪时间轨迹分析表明，SPP1⁺Mps处于终末分化状态。转录因子活性分析显示，JUNB、FOSB、FOS和EGR1是SPP1⁺Mps中的关键调节因子。基因表达模式分析表明，SPP1⁺Mps高表达抗炎（M2型）标志物基因，表现出免疫抑制特性。

3. 肺腺癌中上皮细胞的成分和通路多样性

上皮细胞被鉴定为五个亚群：肺泡II型细胞（AT2）、APOD⁺上皮细胞、基底细胞、纤毛上皮细胞和肺泡I型细胞（AT1）。拷贝数变异（CNV）分析显示，所有上皮亚群均显示出比SPP1⁺巨噬细胞免疫参考集更高的CNV分数，其中基底细胞的CNV分数最高，提示其可能是恶性细胞。细胞丰度分析显示，随着肺腺癌的进展，AT2细胞显著减少，而APOD⁺上皮细胞和基底细胞增加。基底细胞在IAC组中高度富集。生存分析表明，基底细胞的富集与较差的预后相关，而AT2细胞的富集则与较好的预后相关。

4. 由SPP1⁺巨噬细胞和基底细胞组成的细胞通讯模块

细胞通讯分析发现，巨噬细胞与多个上皮细胞群之间存在强烈的相互作用，其中SPP1⁺Mps与基底细胞之间的互作数量最多，且显著相关。配体-受体对分析表明，SPP1⁺Mps通过分泌IL1A、IL1B、IL6和TNF等细胞因子，并可能通过胰岛素样生长因子信号（IGF1/IGFBP3）来支持基底细胞的增殖，从而触发NF-κB通路激活。基于此，研究定义了一个由相互作用的SPP1⁺巨噬细胞和基底上皮细胞及其相关信号程序组成的细胞通讯模块（CIM）。通过LASSO Cox回归模型，从该模块中筛选出13个基因构建了CIM评分系统。TCGA队列生存分析显示，高CIM评分患者预后更差。多重免疫组化技术验证了SPP1⁺Mps和基底细胞的空间共定位模式。

5. CIM组分FAM117A在细胞增殖中的作用

FAM117A在CIM模块中被识别。单细胞数据显示，从正常组织到IAC阶段，FAM117A的表达逐渐增加。对患者组织的验证显示，在肺腺癌组织中，FAM117A的蛋白和mRNA表达水平相较于癌旁组织均下调，而细胞周期促进蛋白Cyclin D1的表达则呈相反趋势。

6. FAM117A通过与DYRK1A相互作用调控G₁/S转换

为了探究FAM117A调控细胞周期进程的分子机制，研究进行了免疫纯化-质谱筛选，发现双重特异性激酶DYRK1A是FAM117A的高分候选结合伙伴。免疫共沉淀实验证实了FAM117A与DYRK1A在肺腺癌细胞中存在特异性相互作用。敲低FAM117A或DYRK1A会导致细胞在G₀/G₁期积累，S期比例下降，表明G₁/S转换减慢。Western Blot分析显示，敲低FAM117A或DYRK1A会导致Cyclin D1蛋白水平升高和CDK4^Thr172磷酸化增强，同时伴随CDK抑制剂p21^Cip1和p27^Kip1的显著减少。共同敲低FAM117A和DYRK1A并未产生比单敲低更强的附加效应，表明两者可能在同一通路或蛋白复合体中发挥功能，共同调控G₁期进程。

7. 敲低FAM117A促进体内肿瘤生长

体内异种移植实验表明，与对照组相比，FAM117A敲低的A549细胞形成的肿瘤生长更快、体积更大、重量更重，证实了FAM117A在体内作为细胞增殖负调控因子的作用。多重免疫组化分析也显示，FAM117A表达降低的区域与肿瘤细胞增殖富集区在空间上相关联。

讨论

本研究通过整合单细胞和批量转录组数据，在侵袭性肺腺癌的肿瘤微环境中，揭示了SPP1⁺巨噬细胞与基底细胞之间的相互作用在塑造癌细胞增殖和免疫治疗抵抗中的潜在作用。SPP1⁺巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子（如IL1A、IL1B、IL6、TNF）和IGF信号（IGF1/IGFBP3）来促进基底细胞的增殖。研究定义的细胞通讯模块（CIM）评分与不良预后显著相关，其中FAM117A被鉴定为关键组分。机制研究表明，FAM117A通过与DYRK1A形成复合物，调控G₁/S检查点，抑制细胞周期进程。FAM117A的缺失破坏了这一检查点，导致细胞增殖加速和肿瘤生长增强。

这些发现揭示了驱动肺腺癌进展的两个汇聚机制：一是SPP1⁺巨噬细胞与基底细胞之间的通讯促进增殖和免疫治疗抵抗；二是FAM117A–DYRK1A轴强制执行G₁/S控制以抑制肿瘤扩展。这强调了肺腺癌微环境中复杂的细胞相互作用，并提示了治疗机会。靶向SPP1⁺巨噬细胞信号和恢复FAM117A–DYRK1A功能可能协同抑制侵袭性肿瘤生长并克服肺腺癌的耐药性。

结论

本研究全面描绘了肺腺癌肿瘤微环境中免疫和非免疫细胞的组成，强调了SPP1⁺巨噬细胞与基底细胞交互网络在驱动肿瘤进展中的核心作用。FAM117A作为连接细胞内在周期调控与外在免疫微环境的关键枢纽，其功能的丧失加剧了恶性循环。这些发现为开发靶向巨噬细胞-肿瘤细胞互作及细胞周期调控节点的联合治疗策略提供了新的理论依据和潜在靶点。