《Poultry Science》：Molybdenum and cadmium co-induced apoptosis and necroptosis via activating endoplasmic reticulum stress and upregulating Caspase-8 expression in duck hepatocytes
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随着工业活动加剧，重金属污染已成为全球性环境与健康难题，其中钼（Mo）与镉（Cd）的复合暴露对肝脏健康的危害尤为显著，但其具体机制尚未完全阐明。本研究通过体内外模型证实，Mo与Cd共同暴露可通过触发内质网应激，进而激活Caspase-8的调控开关，协同诱导鸭肝细胞的凋亡与坏死性凋亡。该发现为揭示重金属复合肝毒性机制提供了新视角，并为开发相应的干预策略奠定了理论基础。
在当今工业化进程中，重金属污染如影随形，尤其以钼（Mo）和镉（Cd）为代表的联合污染，给环境和生物体健康带来了严峻挑战。肝脏作为重要的解毒器官，常常首当其冲，成为重金属“攻击”的靶点。过往的研究虽已表明Mo和Cd单独或联合暴露会引起动物肝脏损伤，并伴随氧化应激、微量元素失衡及细胞凋亡等现象，但关于这两种重金属如何“联手”在分子层面具体搞破坏——特别是它们是否会共同激活特定的细胞死亡程序，以及其间的核心调控开关是什么——这些问题仍然像蒙着一层迷雾。解开这个谜团，对于理解重金属复合污染的毒性本质，以及寻找保护肝脏的有效策略至关重要。
为了拨开这层迷雾，来自江西农业大学的研究团队展开了一项针对性的探索。他们将目光投向了水禽中的重要物种——鸭，通过建立体内（饲喂添加Mo和Cd的饲料）和体外（原代鸭胚胎肝细胞处理）的暴露模型，运用了网络毒理学预测、分子生物学检测以及细胞功能干预等多种技术手段，层层深入地揭示了Mo和Cd协同致毒的分子“路线图”。这项研究成果最终发表在《Poultry Science》上，为我们理解重金属的肝脏毒性机制提供了新的关键拼图。
为了开展此项研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先是网络毒理学分析，利用CTD和GeneCards数据库交叉筛选Mo、Cd诱导肝损伤的潜在靶基因，并通过GO和KEGG富集分析预测关键通路。其次，构建了体内动物模型（40只8日龄雏鸭随机分为对照组、Mo组、Cd组及Mo+Cd联合组，饲喂特定剂量饲料16周）和体外细胞模型（原代鸭胚胎肝细胞，使用不同浓度Mo、Cd及内质网应激抑制剂4-PBA处理）。在机制验证层面，研究通过Western blot蛋白印迹检测了内质网应激标志物GRP78、凋亡执行蛋白Cleaved-Caspase-3、坏死性凋亡关键蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL以及调控蛋白Caspase-8的表达变化。同时，采用流式细胞术和TUNEL染色定量与定位分析细胞凋亡情况，利用免疫荧光和免疫组化观察p-MLKL的定位与表达，并通过透射电子显微镜观察了肝细胞亚细胞结构（特别是内质网）的形态学变化。最后，通过siRNA敲低和质粒过表达技术，在细胞水平上对关键调控因子Caspase-8进行了功能增益与缺失实验，以验证其在细胞死亡途径中的核心作用。
研究结果
1. Mo或/和Cd诱导鸭肝组织发生凋亡与坏死性凋亡
研究者首先通过生物信息学分析（网络毒理学）预测，Mo和Cd诱导肝损伤主要与凋亡、坏死性凋亡及内质网应激等通路相关。在动物实验层面，对饲喂了Mo和/或Cd的鸭肝组织进行分析发现：TUNEL染色显示，各处理组（尤其是联合暴露组）的凋亡阳性细胞显著增加；免疫组化及Western blot结果则表明，与坏死性凋亡相关的关键蛋白RIPK3、RIPK1、MLKL及p-MLKL的水平在联合暴露组上调最为明显，而Caspase-8及其活化形式（Cleaved-Caspase-8）的水平则呈现下降趋势。这些结果共同证实，Mo和Cd联合暴露能够同时诱导鸭肝组织发生凋亡和坏死性凋亡。
2. Mo或/和Cd在体外诱导鸭胚胎肝细胞发生凋亡、内质网应激与坏死性凋亡
在原代鸭肝细胞模型中，研究者首先通过CCK-8法确定了Mo和/或Cd处理8小时和12小时为关键毒性时间点。随后的实验表明：流式细胞术和TUNEL染色均显示，Mo+Cd联合处理显著增加了细胞的晚期凋亡和坏死率。Western blot检测发现，凋亡执行蛋白Cleaved-Caspase-3以及内质网应激标志物GRP78的表达均被显著上调。透射电镜观察更直观地显示，处理后的细胞出现了内质网肿胀和破裂的特征。有趣的是，关于坏死性凋亡的标志物，在暴露8小时时，RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL蛋白水平下调，而Caspase-8水平上调；但在暴露12小时时，情况完全逆转，坏死性凋亡标志蛋白上调，Caspase-8下调。这表明Mo和Cd诱导的坏死性凋亡存在时间依赖性，在后期（12小时）表现更为显著。
3. 内质网应激介导了Mo和Cd协同诱导的凋亡与坏死性凋亡
为了探究内质网应激（ERS）是否在上述过程中扮演“中介”角色，研究者在细胞模型中加入了内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA）。结果显示，4-PBA的共处理显著逆转了由Mo+Cd引起的GRP78蛋白升高。更重要的是，4-PBA也同时减轻了Mo+Cd所导致的细胞凋亡（Cleaved-Caspase-3水平下降，流式和TUNEL结果支持）和坏死性凋亡（p-MLKL荧光减弱，RIPK1、RIPK3、MLKL等蛋白水平降低）。这一系列实验确凿地证明了，内质网应激是Mo和Cd协同触发鸭肝细胞凋亡与坏死性凋亡的共同上游通路。
4. Caspase-8调控Mo和Cd协同诱导的凋亡与坏死性凋亡
最后，研究者将焦点放在了关键调控蛋白Caspase-8上。通过siRNA敲低和质粒过表达技术，他们发现：当敲低Caspase-8后，Mo+Cd诱导的细胞凋亡（Cleaved-Caspase-3水平及凋亡率）被抑制，而坏死性凋亡（RIPK1、RIPK3、MLKL、p-MLKL水平）却被促进。相反，过表达Caspase-8则得到了完全相反的结果：凋亡增强，而坏死性凋亡被抑制。这些结果清晰地揭示了Caspase-8在Mo和Cd诱导的细胞死亡中扮演着“分子开关”的核心角色：活化的Caspase-8通过切割RIPK1来抑制其介导的坏死性凋亡通路，同时促进RIPK1依赖的凋亡通路。
研究结论与意义
本研究首次系统性地阐明，环境中常见的重金属污染物钼（Mo）和镉（Cd）的联合暴露，能够通过激活内质网应激（ERS），共同诱导鸭原代肝细胞发生凋亡和坏死性凋亡这两种程序性细胞死亡。更为重要的是，研究发现了Caspase-8在这一过程中的核心调控作用：它像一位“交通警察”，其活性水平决定了细胞死亡的“方向”——当Caspase-8被上调激活时，它通过切割RIPK1，关闭坏死性凋亡的“绿灯”，同时打开凋亡的“通道”；反之，当Caspase-8功能被抑制时，细胞则更倾向于走向坏死性凋亡。
这项研究的重大意义在于，它不仅填补了Mo和Cd复合暴露对水禽（特别是鸭）肝毒性分子机制认知上的空白，将毒性效应的认识从现象描述推进到了精确的分子通路阐释层面；更重要的是，它揭示了内质网应激和Caspase-8/RIPK1轴是重金属协同肝毒性的关键节点。这为未来开发针对性的解毒剂或干预策略（例如，靶向调节内质网应激或Caspase-8活性）提供了潜在的理论依据和全新的药物靶点，对于保障养殖业健康、评估环境重金属复合污染风险具有重要的科学价值和应用前景。
