《Aquaculture Science and Management》：Evaluation of different stocking densities on growth parameters, digestive enzymes, hemato-immunological and stress responses of Cirrhinus reba (Hamilton, 1822)
引言
水产养殖业在全球改善营养安全和减贫方面发挥着重要作用，同时提升了贫困农民的社会经济地位并促进了该行业的就业。鲤科鱼类，特别是鲤鱼，构成了印度水产养殖的支柱，贡献了总产量的85%。将诸如巴塔鱼、潘蒂乌斯鱼、彭巴鱼等小型鲤科鱼类与印度主要鲤鱼一同引入养殖系统，可以丰富传统的水产养殖模式。其中，雷巴野鲮（Cirrhinus reba）是一种分布于印度次大陆的重要食用鱼。它被认为是最重要的本土小型鲤科鱼类之一。雷巴鱼是一种生态友好型鱼类，也是动物源性营养素的重要来源。由于其诱人的大小、高营养价值、美味的口感以及鱼刺较少，雷巴鱼深受人们喜爱。在印度北部和东北部，雷巴鱼非常受欢迎，通常整条食用，市场需求和价格较高（200-250印度卢比/公斤），是一种适合水产养殖的物种。然而，由于过度捕捞和各种人类活动导致其自然产卵和生长栖息地的丧失，野生种群正在迅速减少。
放养密度是决定鱼类养殖系统经济可行性的关键因素，因为它直接影响养殖鱼类的生长、存活和净产量。鱼类密度是指单位养殖水体体积中放养的鱼的数量。商业水产养殖中常采用高密度养殖以获得更高的产量和效益。假设养殖环境中的拥挤是影响鱼类生理机能，进而影响其健康状况的最重要胁迫因素之一。先前的研究已探讨了不同放养密度对多种鱼类生长性能和存活的影响，例如彭巴鱼（Osteobrama belangeri）、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、马贾拉雅普通鲤鱼（Cyprinus carpio）、卡特拉鲃（Catla catla）和露斯塔野鲮（Labeo rohita）等。然而，雷巴鱼的半精养商业化生产尚未建立。因此，为满足对高质量动物蛋白的需求，需要对重要物种采用半精养实践。本研究旨在通过优化雷巴鱼在室外水泥池半精养系统中45天鱼种生产的放养密度，来开发相应的培育技术。
材料与方法
伦理声明
本研究的伦理批准、样本采集和维护均严格遵守印度特里普拉中央农业大学渔业学院动物伦理委员会的伦理标准建议。
实验地点与设计
本研究在印度特里普拉莱姆布切拉的渔业学院进行。实验采用完全随机设计（CRD），使用容积为20立方米（5米×4米×1米）的水泥池。将鱼苗分为三个处理组，每组设三个重复，分别为SD1（10尾/立方米）、SD2（20尾/立方米）和SD3（30尾/立方米），养殖45天。在设计本次研究的放养密度之前，先进行了为期45天的预实验，测试了五种不同的放养密度，并根据结果排除了不显著的密度。
饲料制备与近似成分
使用选定原料配制了等氮（30%粗蛋白）饲料。所有原料均购自特里普拉中央农业大学渔业学院的饲料厂。将原料在容器中充分混合形成均匀混合物，并制成面团。面团在高压灭菌锅中蒸煮20分钟以使淀粉充分糊化，然后冷却。随后添加维生素-矿物质混合物等微量营养素。通过孔径为1毫米的制粒机将面团压制成均匀颗粒。颗粒在45°C的热风烘箱中干燥12小时，然后装入密封容器中。混合物随后储存在干燥阴凉处以供后续投喂实验鱼使用。
饲料的近似成分通过标准方法进行分析。饲料配方和近似成分如表1所示。水分含量通过在105°C热风烘箱中干燥样品至恒重进行分析。粗蛋白（CP）含量通过标准设备（TecatorTM消化器和KjeltecTM8400分析仪单元，FOSS）测定，粗脂肪（CL）含量通过索氏脂肪提取器（Labtec ST310溶剂，FOSS）估算。粗纤维（CF）含量通过纤维分析仪（fibraplus–FES 06 AS）测定，总灰分（TA）含量通过在550°C的马弗炉中灼烧5小时测定。无氮浸出物（NFE）通过扣除法用以下公式计算：
NFE = 100 ? (%CP + %EE + %CF + %TA)
实验设置与鱼类管理
水泥池铺设了8厘米厚的底泥，并在实验开始前进行干燥和充分曝晒。整个池塘按照标准管理实践进行准备。池塘首先清洁，按300公斤/公顷（每池100克CaO）的比例施用石灰，然后注入地下水，保持水位在90厘米。石灰处理后一周，分两次施用浸泡过的芥菜籽饼进行施肥，每池用量为750克。
放养操作遵循鲤鱼养殖操作规程进行。鱼苗取自特里普拉中央农业大学渔业学院的养殖场。鱼苗在早晨进行适应和存放。15日龄雷巴鱼苗的初始平均长度和体重分别为3.81 ± 0.26厘米和0.59 ± 0.09克。使用颗粒饲料（粒径0.6毫米）投喂，初始投喂率为鱼体重的6%（每天两次；上午10:00和下午04:00），每两周调整一次，后续调整至体重的4%。为防止鸟类捕食，池塘用尼龙网覆盖。
水质参数
在实验期间监测水质参数。使用摄氏温度计记录水温。使用光学溶解氧探头（ProODOTM, YSI Environmental）测量溶解氧，使用数字pH计（HI 991,001, HANNA）记录pH值。总碱度、硬度、游离二氧化碳、铵态氮（NH4+-N）、亚硝态氮（NO2-N）和硝态氮（NO3-N）通过标准滴定法测定。净初级生产力（NPP）和总初级生产力（GPP）（毫克碳/平方米/小时）通过标准方法（即明暗瓶法）在特定时间间隔测定。
生长性能
生长性能指标包括平均终末长度、平均终末体重、特定生长率（SGR）、日均增重（MDWG）和存活率（SR），通过以下公式计算：
平均终末长度 = 终末长度 - 初始长度
平均终末体重 = 终末体重 - 初始体重
SGR（%/天） = （终末体重对数 - 初始体重对数）/ 养殖天数 × 100
MDWG（%） = （终末体重 – 初始体重）/ 时间（天） × 100
存活率（%） = （最终存活尾数 / 初始放养尾数） × 100
饲料利用参数，即表观饲料转化率（AFCR）和表观蛋白质效率比（APER），通过以下公式计算：
AFCR = 饲料消耗量（克）/ 增重（克）
APER = 活体增重（克）/ 蛋白质消耗量（克）
鱼类健康参数
肝体指数（HSI）、肥满度（K）和相对丰满度（RF）被视为鱼类健康参数，通过以下公式计算：
HSI = （肝脏重量（克）/ 鱼总重（克）） × 100
K = （体重（克） × 100）/ 体长（厘米）3
RF = （体重 - 内脏重量）/ 体长3× 100
消化酶活性
样品制备
实验结束后，称量鱼种以计算生长指数。从每个池中随机捞取五尾鱼，用丁香酚（50微升/升）麻醉后处死，采集肠道用于消化酶分析。将肠道组织称重，在冰冷的250毫摩尔蔗糖溶液中匀浆并离心（5000转/分，15分钟）。用移液器将上清液收集到Eppendorf管中，并储存于-20°C。
肠道中的蛋白质含量通过分光光度法进行定量。测定的组织蛋白质含量用于估算消化酶的比活性。
消化酶活性
通过酪蛋白消化法测定肠道中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性。
血液学测定
血液采集
从每个池中随机捞取鱼，用丁香酚（50微升/升）麻醉。从尾静脉采血。使用预先用2.7% EDTA盐溶液冲洗过的1毫升注射器和26号针头，立即将血液转移至涂有EDTA（作为抗凝剂）的干燥Eppendorf管中，充分摇匀以防止溶血，并置于4°C保存。另从每个池中采集两到三尾鱼用于收集应激反应参数的血液。
血液参数
血液参数包括血红蛋白（Hb）、红细胞（RBC）、红细胞压积（Hct）、白细胞（WBC）及其衍生指标平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC），均通过血液分析仪（Exigo）进行分析。
血糖和皮质醇被视为应激反应参数。血糖含量使用美国ERBA诊断公司的标准血糖仪进行分析。皮质醇使用经过验证的放射免疫分析（ELISA LDN-MS E-5000）试剂盒（购自孟买Diagnostic Systems Laboratories）进行估算。该程序遵循酶免疫测定测试的基本原理，即未标记抗原和酶标记抗原竞争固定数量的抗体结合位点。与抗体结合的酶标记抗原的量与存在的未标记分析物的浓度成反比。通过倾析和洗涤孔板去除未结合的物质。血清皮质醇以纳克/分升表示。
统计分析
数据通过单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，并使用SPSS 22.0版软件，通过Duncan多重范围检验在5%水平上解释数据，以确定均值之间的显著性差异。数据以平均值 ± 标准误（SE）表示。
结果
水质参数
各实验组水质理化参数的范围如表2所示。水温（°C）、pH、溶解氧（DO，毫克/升）、总碱度（毫克/升）、二氧化碳（CO2，毫克/升）、硬度（毫克/升）、铵态氮（NH4+-N，毫克/升）、亚硝态氮（NO2-N，毫克/升）、硝态氮（NO3-N，毫克/升）、磷酸盐磷（PO4-P，毫克/升）的范围分别为28.43-33.10、7.89-8.17、7.20–10.0、54.00–73.33、0.00–4.99、43.33–62.00、0.15–0.43、0.07–0.24、0.18–0.18、0.05–0.62。净初级生产力（NPP）和总初级生产力（GPP）（毫克碳/平方米/小时）在各实验组间未受显著影响（p > 0.05），其值列于表3。
生长性能
生长性能指数如表4所示。在SD1组（放养密度10尾/立方米）中观察到显著提高（p < 0.05）的生长性能，其特定生长率（SGR，5.38%/天）和日均增重（MDWG，13.40%）、存活率（88.33%）、表观饲料转化率（AFCR，1.05）和表观蛋白质效率比（APER，1.92）均优于SD2和SD3组。肥满度、肝体指数（HSI）和相对丰满度在各组间未受显著影响（p > 0.05），具体数值见表4。
消化酶活性
雷巴鱼肠道消化酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶）的活性如图1所示。蛋白酶活性在SD1组（1.43单位/毫克蛋白质/分钟）显著高于（p < 0.05）其他组，在SD3组最低（0.91单位/毫克蛋白质/分钟）。脂肪酶活性在SD1和SD2组之间无显著差异，但SD3组的活性显著较低（p < 0.05）。淀粉酶活性在各实验组间无显著差异。
血液学测定
血液免疫学参数的值如表5所示。血红蛋白（Hb）、红细胞（RBC）、红细胞压积（Hct）、平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白（MCH）、平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）和白细胞（WBC）计数等参数在各实验组之间均无显著差异（p > 0.05）。
应激反应参数血糖和皮质醇受不同放养密度的显著影响，如图2所示。血糖的最低值出现在SD1组（46.96毫克/分升），其次是SD2组（50.20毫克/分升）和SD3组（56.68毫克/分升）。同样，皮质醇值也在SD1组最低（310.93纳克/分升），其次是SD2组（348.24纳克/分升）和SD3组（381.34纳克/分升）。
讨论
养殖环境的理化参数在鱼类天然饵料生物的生产以及维持健康水环境方面起着重要作用。鱼类的生长性能、饲料效率和饲料消耗通常依赖于水质和其他生态因素。
水质参数
本实验在适宜的水温（28.43–33.10 °C）、pH（7.65–8.17）和溶解氧浓度（7.20–10.00毫克/升）下进行。此外，整个实验期间的所有水质参数均在鲤鱼养殖的允许范围内。所有池塘中的初级生产力（NPP和GPP）也被发现对鱼类有利，这得到了先前说明不同鲤鱼养殖中水生产力的报告的支持。
生长性能
养殖环境中的放养密度是一个关键因素，也是水产养殖实践中公认的因素。在较低放养密度（10尾/立方米）的SD1组中观察到优越的生长性能指数（SGR、MDWG、存活率、AFCR和APER），这可能归因于相较于其他组，其在饲料和空间上的竞争更少或应激水平更低。本研究证实了先前发表的研究报告，这些报告揭示了在各种养殖环境中改善的生长性能。
消化酶活性
营养物质被运送到动物组织中，融入细胞代谢机制，并为生长和其他活动提供能量。蛋白酶比活性在SD1组显著高于（p < 0.05）SD2和SD3组，而脂肪酶比活性在SD1和SD2组显著高于SD3组，这表明在本研究中，较低的雷巴鱼放养密度可能增加了营养物质（蛋白质和脂类）的利用和同化。这可能是由于食物和空间竞争减少，导致SD1组的生长优于SD2和SD3组。本研究得到了先前研究结果的支持，这些研究表明较高的放养密度会降低消化酶的比活性。
血液学测定
相对较高的放养密度会导致拥挤胁迫，鱼类在养殖环境中会发生许多生理变化。在应激源中，初级和次级应激源负责代谢、血液学和结构变化，而三级应激源则影响整个动物。通常，血细胞数量反映了养殖动物的状况。本研究中，血细胞计数（Hb、Hct、MCV、MCH、MCHC和WBC）均在正常范围内，且组间无显著差异（p > 0.05），表明放养密度未影响血液参数，这可能是因为放养密度对血液参数的影响较小，这与Rafatnezhad等人的观察结果相似。
多种因素经常影响水产养殖系统中的鱼类应激，例如环境温度、放养密度、操作、水体理化参数、运输和分选，这些都会对鱼类的生长和健康产生负面影响。在存在应激的情况下，动物的下丘脑-垂体-肾间组织（HPI）轴受到刺激，导致儿茶酚胺和皮质类固醇浓度升高，从而引发高血糖。皮质醇水平被认为是应激的主要反应，其升高是因为应激会引发高血糖并削弱鱼类的免疫系统。血糖水平被认为是应激的次级反应。血糖浓度是评估各种应激源（包括物理因素和污染物）影响的有效指标。养殖环境中相对较高的放养率会发生竞争性相互作用，而拥挤胁迫可能是在相对较低放养率（SD1）下葡萄糖和皮质醇水平降低的原因。类似地，在空间更充足、饲料更丰富的适宜环境中饲养的鱼类，在SD1组表现出较低的应激和改善的免疫反应。相比之下，血糖和皮质醇升高可能是雷巴鱼在相对较高放养密度（SD2和SD3）下面临较高水平拥挤胁迫而导致生长减缓的原因。本研究得到了相关发现的支持，即较高的放养率会增加各种鲤鱼和其他鱼类物种的葡萄糖和皮质醇水平。
结论
雷巴野鲮（C. reba）可以作为混养和多样化淡水水产养殖的候选物种。本研究结果表明，在所研究的体重范围内，10尾/立方米的放养密度对于提高雷巴鱼的生长性能和消化酶活性、减少拥挤胁迫而言是最佳的。相反，相对较高的放养密度（>10尾/立方米）会抑制生长性能并增加拥挤胁迫。然而，雷巴鱼的培育实践需要在不同温度条件和不同养殖系统中进行大量研究。本研究将为在不同条件下优化这种重要经济小型鲤科鱼类在土池中的放养密度提供基线依据。
